Nhiễm sắc thể phát sinh (derivative chromosome)
Nhiễm sắc thể phát sinh (der) là sắp xếp lại cấu trúc nhiễm sắc thể được tạo ra bằng cách sắp xếp lại hai hoặc nhiều hơn nhiễm sắc thể liên quan hoặc nhiều bất thường trong một nhiễm sắc thể duy nhất . Thuật ngữ này luơn luơn liên quan đến nhiễm sắc thể cĩ một tâm động cịn nguyên vẹn [9].
Nhiễm sắc thểmarker(mar)là một nhiễm sắc thể nhỏ khơng rõ nguồn gốc, xuất xứ theo quy định được gọi là nhiễm sắc thể đánh dấu (mar) [34]. Đây nhiễm sắc thể bất thường về cấu trúc mà khơng thể xác định hay mơ tả được một cách rõ ràng bằng kỹ
thuật di truyền tế bào nhuộm băng thơng thường. Kí hiệu “mar” bắt buộc viết sau dấu “+”..[9]
Thêm vật liệu khơng rõ nguồn gốc (additional Material of Unknow Origin): Kí hiệu “ add” thường dùng để chỉ vật liệu khơng rõ nguồn gốc được thêm vào vùng hoặc vị trí băng nào đĩ trên nhiễm sắc thể. Cũng giống như bất thường được biểu diễn bởi kí hiệu “t” và “?”, ví dụ như t(1;?)(q36;?), nhưng thật khĩ mà nhận ra sự tái sắp xếp lại thật sự là kết quả của chuyển đoạn. Ký hiệu add khơng chỉ ra bất cứ cơ chế đặc biệt nào [9].
Biến thể về kích thước của nhiễm sắc thể (Variation in Length) : Sự biến thể về chiều dài của đoạn dị nhiễm sắc chất (h), stalk (stk) hoặc vệ thể (s) được phân biệt từ sự tăng hay giảm chiều dài của cánh do sự biến đổi về cấu trúc bằng cách dùng kí hiệu “+” hay “-“ sau các kí hiệu h, stk, s
16qh+ Tăng chiều dài dị nhiễm sắc trên cánh dải nhiễm sắc thể 16 Yqh- Giảm chiều dài dị nhiễm sắc trên cánh dải nhiễm sắc thể Y 21ps+ Tăng chiều dài vệ thể trên cánh ngắn nhiễm sắc thể 21 22pstk+ Tăng chiều dài thântrên cánh ngắn nhiễm sắc thể 22
Biến thể về số lượng và vị trí:
17ps Vệ thể trên cánh ngắn nhiễm sắc thể 17 Yqs Vệ thể trên cánh dài nhiễm sắc thể Y
9phqh Dị nhiễm sắc chất trên cả cánh dài và ngắn nhiễm sắc thể 9 9ph Dị nhiễm sắc chất trên cánh ngắn nhiễm sắc thể 9
1q41h Đoạn dị nhiễm sắc chất trên nhiễm sắc thể 1 tại băng 1q41 21pss Gấp đơi vệ thể trên cánh ngắn nhiễm sắc thể 21
CHƯƠNG 2
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu
Máu ngoại vi được thu lấy từ hai nhĩm nghiên cứu:
• Nhĩm 1 (nhĩm bệnh lý): là những cặp vợ chồng cĩ hiện tượng sẩy thai hoặc thất bại trong thụ tinh ống nghiệm lặp lại ít nhất 2 lần, hoặc được chẩn đốn vơ sinh nguyên phát. Đây là những bệnh nhân đến xét nghiệm tại Phịng xet nghiệm Di truyền – Trung Tâm Y Khoa Medic được thống kê từ tháng 03/2008 đến tháng 9/2011. Cỡ mẫu là 320 cặp vợ chồng.
• Nhĩm 2 (nhĩm đối chứng): là những người tình nguyện tham gia cĩ khả năng sinh sản bình thường, chưa từng bị sẩy thai, thai lưu và khơng trải qua đợt điều trị hiếm muộn nào trước khi mang thai. Mẫu nhĩm chứng được thu thập từ tháng 5/2011 đến tháng 9/2011. Cỡ mẫu là 50 cặp vợ chồng.
Các tuổi của các đối tượng phụ nữ gọi dao động từ 21-40 tuổi, trong khi tuổi của các đối tượng nam giới từ 25-45 tuổi.
Nơi thực hiện đề tài : Phịng xét nghiệm di truyền tế bào, Trung tâm Y khoa Medic. Thời gian thực hiện đề tài : từ tháng 5/2011 đến tháng 10/2011 2.2 Vật liệu và Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Vật liệu Dụng cụ: Lame Lamelle Ống nghiệm thủy tinh 15ml
Pippet nhựa 3ml Pippet thủy tinh Pippet Pasteur
Bơm kim tiêm Găng tay vơ trùng
Khẩu trang Đèn cồn Lọ Coplin thủy tinh Lọ Coplin jar Kẹp inox đầu gập… Thiết bị :
Kính hiển vi quang điện tử Olypus BX51 kết nối với hệ thống camera và máy vi tính thu nhận hình ảnh. Phần mềm xử lý hình ảnh Ikaros của Metasystem (Đức). Kính hiển vi quang học CX21 Kính hiển vi phản pha CX31 Tủấm 37oC Máy ly tâm Máy đo pH Cân phân tích Máy khuấy từ
Máy vortex Bồn cách thủy (waterbath) Hotplate Tủ sấy Tủ cấy vi sinh Hĩa chất:
Mơi trường RPMI 1640 (Invitrogen) PHA (Phytohemagglutinine, Invitrogen)
Huyết thanh phơi bị FBS (Fetal Bovine Serum, Invitrogen) Antibiotic – Antimycotic (Invitrogen)
Heparine Sodium 25000 UI
Demecolchin Solution (Invitrogen)
KCl 0,0075M NaCl KH2PO4 Na2HPO4 Giemsa Trypsine
Carnoy (acid acetic 100%: methanol 100% = 1:3)
Buffer pH 7 Buffer pH 4 Buffer pH 9 NaOH HCl Acid Acetic
Keo canada balsam (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Dầu soi
2.2.2 Thiết kế phương pháp nghiên cứu
a. Sơ đồ tổ chức thí nghiệm Hình 2.1 Sơ đồ quy trình thực hiện nhiễm sắc thể đồ Máu tồn phần chống đơng bằng Heparin Sodium Nuơi cấy 37oC/72h Nhuộm băng: GTG (400 băng) Thu hoạch tế bào, cố định, làm tiêu bản Đọc và phân tích kết quả
b. Thiết kế thí nghiệm:
Máu ngoại vi của hai nhĩm đối tượng được thu lấy từ tĩnh mạch bằng kim tiêm vơ trùng sau khi bệnh nhân nhịn đĩi 4-5 giờ, cho vào ống chứa cĩ chất chống đơng heparin sodium, lắc kỹ, bảo quản ở nhiệt độ 4oC cho đến khi thực hiện nuơi cấy.
Nuơi cấy máu ngoại vi trong 72 giờ bằng mơi trường RPMI 1640 cĩ bổ sunng các thành phần dinh dưỡng phù hợp.
Thu hoạch cụm mitose bằng cách xử lý demecolchine dừng phân bào ở trung kỳ.
Nhuộm băng GTG (400 băng) Đọc và phân tích kết quả
2.2.3 Chuẩn bị mơi trường
Mơi trường sử dụng để nuơi cấy là RPMI 1640 được bổ sung các thành phần sau: FBS (Huyết thanh phơi bị), PHA (Phytohemagglutinine), Antibiotic(kháng sinh) và Heparin sodium 25000UI. Các thành phần được trộn đều và phân mơi trường vào các ống nghiệm (5ml/ống nghiệm). Việc chuẩn bị mơi trường đều thực hiện trong điều kiện vơ trùng. Bảo quản mơi trường ở -20oC, rã đơng và ủ trong bể điều nhiệt 37oC 30 phút trước khi thực hiện quy trình cấy.
RPMI 1640 100ml
FBS 20ml
PHA 2,5ml 5ml/ống nghiệm Antibiotic- Antimycotic 2ml
RPMI 1640 được phát triển bởi Moore và các cộng sự tại viện Roswell Park Memorial, nên được viết tắt là RPMI (Roswell Park Memorial Institute). RPMI 1640 được cải tiến nhiều dự trên RPMI 1630 cĩ thay đổi một số acid amin và vitamin. RPMI 1640 đã được chứng minh hổ trợ tăng trưởng của nhiều loại tế bào trong nuơi cấy, đặc biệt là tế bào lympho người với sự bổ sung của Phytohemagglutinine (PHA) [8].
Huyết thanh phơi bị (FBS – Fetal Bovine Serum) là phần cịn lại trong huyết tương sau khi đơng tụ máu, trong quá trình protein huyết tương fibrinogen được chuyển đổi thành fibrin và vẫn cịn lại sau khi đơng máu. Huyết thanh phơi bị được sử dụng phổ biến nhất trong nuơi cấy tế bào in vitro các tế bào cĩ nhân điển hình. Bởi vì huyết thanh phơi bị cĩ một nồng độ thấp của các kháng thể và cĩ chứa yếu tố tăng trưởng [8].
Phytohemagglutinine (PHA) là một loại lectin được tìm thấy ở thực vật, đặc biệt là cây họ đậu. Nĩ được tìm thấy ở nồng độ cao nhất trong đậu chưa chín màu đỏ và đậu trắng và nĩ cũng được tìm thấy ở nồng độ thấp hơn ở các loại đậu xanh và đậu thơng thường khác (Phaseolus Vulgaris). Lectin cĩ một số hiệu ứng chuyển hĩa tế bào, nĩ gây ra sự gián phân và ảnh hưởng đến các màng tế bào liên quan đến vận chuyển và tính thấm với protein. Trong y học PHA được sử dụng như một nhân tố kích hoạt phân chia tế bào ở tế bào lympho [8].
Kháng sinh và kháng nấm (Antibiotic – Antimycotic) được bổ sung vào mơi trường mục đích hạn chế ngoại nhiểm của vi sinh và vi nấm vào mơi trường nuơi cấy. Thơng thường được sử dụng là Penicillin (10,000 UI/ml) và Streptomycin (10mg/ml).
Heparin sodium cĩ tác dụng chống máu đơng trong và ngồi cơ thề trơng qua tác dụng lên antithrombin III. Bổ sung thêm Heparin vào mơi trường để tác dụng chống máu tồn phần tạo các cục máu đơng.
2.2.4 Quy trình nuơi cấy
- Cho 1ml máu tồn phần vào ống nghiệm thủy tinh chứa 5ml mơi trường nuơi cấy.
- Lắc đều, đặt vào tủấm 37oC.
- Nuơi cấy trong 72 giờ, mỗi ngày lắc máu 2 lần.
2.2.5 Thu hoạch cụm mitose
+ Bước 1: Ức chế sự phân bào
Sau khi nuơi cấy 37oC, đến giờ thứ 70 sau nuơi cấy, nhỏ vào ống mơi trường cấy máu 100µ l Demecolchine 10µ g/ml, ủ 10 phút ở 37oC. Demecolchin làm đứt thoi vơ sắc, ức chế phân bào ở giai đoạn trung kỳ, ở giai đoạn này, các nhà nghiên cứu thấy rằng nhiễm sắc thể cĩ kích thước lớn và hình dạng rõ nhất.
+ Bước 2: Nhược trương tế bào
Chuyển tồn bộ dịch nuơi cấy sau khi ủ với colchicine vào ống ly tâm 15ml, ly tâm 1500 vịng/phút, bỏ dịch nổi thu cặn, cho 6ml dung dịch nhược trương KCl 0,075M, sốc nhược trương bằng máy vortex. Ủ trong bồn cách thủy 37oC 20 phút. Ly tâm 1500 vịng/phút, bỏ dịch nổi thu cặn.
+ Bước 3 : Làm sạch cặn thừa trong dung dịch
Cho 6ml Acid acetic 5% vào ống ly tâm, lắc kỹ, ly tâm 1500 vịng/phút, bỏ dịch nổi thu cặn.
+ Bước 4 : Cố định nhiễm sắc thể (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Để giữ hình dạng nhiễm sắc thể ở trung kỳ cần định hình bằng dung dịch Carnoy. Bước định hình đầu tiên, dùng 6ml dung dịch Carnoy vào mỗi ly tâm nhọn đáy, lắc nhẹ, để 15 phút ở nhiệt độ phịng, ly tâm trong 1500vịng/phút trong 10 phút, hút bỏ phần ở trên.
Bước định hình tiếp theo bằng dung dịch Carnoy , cho vào mỗi ống ly tâm nhọn đáy 6ml, lắc nhẹ, ly tâm 1500vịng /phút trong 10 phút, hút bỏ phần trên, lấy dịch ở đáy ống ly tâm.
Làm trong dung dịch tế bào bằng Carnoy, cho vào mỗi ống ly tâm 6ml, lắc nhẹ, ly tâm1500vịng /phút trong 10 phút, hút bỏ phần trên, lấy dịch ở đáy ống ly tâm làm tiêu bản. Nếu khơng làm tiêu bản thì cho 5ml Carnoy vào, lưu trữở -20oC.
+ Bước 5 : Làm tiêu bản
Sử dụng lame kính sạch, ngâm lame kính trong cồn tuyệt đối ở nhiệt độ 4oC cho đến khi nhỏ tiêu bản. Dùng pipet thủy tinh lấy dung dịch căn và kéo lên lame kính sao cho hỗn dịch lan theo mặt lame và tan đều trên mặt lame. Khi đĩ các nhiễm sắc thể hiện diện trên lame kính thành từng cụm.
2.2.6 Quy trình nhuộm band G (sử sụng Trypsine và Giemsa) 2.2.6.1 Nguyên tắc: 2.2.6.1 Nguyên tắc:
Dưới tác dụng của Trypsine làm phá vỡ cấu trúc protein của nhiễm sắc thể. Vùng trên nhiễm sắc thể cĩ nhiều protein thì thời gian Trypsine phá vỡ lâu hơn, ngược lại vùng trên nhiễm sắc thể cĩ ít protein thì thời gian Trypsine phá vỡ nhanh hơn. Giemsa tương tác với protien trên nhiễm sắc thể hình thành nên những vạch bắt màu sáng tối khác nhau trên nhiễm sắc thể cho hình ảnh nhiễm sắc thể với các vạch băng [8].
Hình 2.2 Tiêu bản sau khi xử lý Trypsine và nhuộm Giemsa (TTYK Medic)
2.2.6.2 Quy trình nhuộm band – G
Sau khi nhỏ lame, tiêu bản được cố định bằng nhiệt ở 60oC qua đêm. Để lame ở nhiệt độ phịng 5 phút trước khi xử lý với Trypsine. Nhúng lame vào Trypsine 0,05% 5-10 giây.
Nhúng lame vào PBS 1X lần 1, 1 giây. Nhúng lame vào PBS 1X lần 2, 1 giây. Nhuộm Giemsa 5 phút.
Rửa sạch bằng nước cất.
2.2.7 Đọc và phân tích kết quả Nhiễm sắc thể đồ
Kiểm tra các cụm mitose bằng kính hiển vi quang học: đọc số lượng và khảo sát cấu trúc nhiễm sắc thể ít nhất là 20 tế bào cho mỗi bệnh nhân. Lựa chọn những cụm trung kỳ điển hình để phân tích bằng cách ghi nhận lại tọa độ.
Chụp hình bằng kính hiển vi quang điện tử BX51 cĩ kết nối với hệ thống camera. Thu nhận hình ảnh qua phần mềm phân tích nhiễm sắc thể. Sử dụng các tính năng của phần mềm để phân tách và sắp xếp bộ nhiễm sắc thể .
Mơ tả kết quả bằng quy ước của danh pháp di truyền quốc tế ISCN 2009[9].
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ BIỆN LUẬN 3.1. Phân nhĩm đối tượng nghiên cứu
Số liệu nghiên cứu được thống kê từ tháng 3/2008 đến tháng 9/2011 tại phịng xét nghiệm Di truyền tế bào, Trung Tâm Y Khoa Medic. Dựa trên hồ sơ bệnh án và dấu hiệu lâm sàng, tổng kết cĩ 320 cặp vợ chồng vơ sinh hiếm muộn được chỉ định thực hiện nhiễm sắc thể đồ máu. Trong đĩ, sẩy thai liên tiếp là trường hợp gặp nhiều nhất (nhĩm A) 301 cặp, chiếm gần 94,1%; nhĩm thất bại trong thụ tinh ống nghiệm (nhĩm B) 15 cặp, chiếm 4,7% và 4 cặp được chẩn đốn lâm sàng là vơ sinh nguyên phát (nhĩm C) chiếm 1.25% (hình 3.1).
A: Sẩy thai liên tiếp B: IVF thất bại C: Vơ sinh I
Hình 3.1 Phân nhĩm đối tượng khảo sát nhiễm sắc thể
Quan sát nhiễm sắc thể đồ trên 3 nhĩm nghiên cứu, kết quả cho thấy nhĩm A cĩ 247 cặp vơ chồng (82.06%) cĩ nhiễm sắc thể đồ bình thường và 54 (17.94%) cặp cĩ nhiễm sắc thể đồ bất thường. Nhĩm B cĩ 9 cặp (60%) cĩ nhiễm sắc thể đồ bình thường và 6 cặp (40%) cĩ nhiễm sắc thể đồ bất thường. Nhĩm C cĩ 2 cặp (50%) cĩ nhiễm sắc thể đồ bình thường và 2 cặp (50%) cĩ nhiễm sắc thể đồ bất thường (hình 3.2).
1.25% 94.1% 4.7%
0.00% 10.00% 20.00% 30.00% 40.00% 50.00% 60.00% A B C STLT IVF thất bại Vơ sinh I
Hình 3.2. Tỉ lệ bất thường Nhiễm sắc thể đồ trên 3 nhĩm khảo sát
3.2. Các bất thường nhiễm sắc thể quan sát được trong nhĩm vơ sinh hiếm muộn
Trên 640 cá thể khảo sát, tỉ lệ bất thường nhiễm sắc thể quan sát được là 9,69%. Xét trên 320 căp vợ chồng cĩ hiện tượng vơ sinh, tỉ lệ bất thường nhiễm sắc thể xảy ra ở người nam là 11.9%, và ở người nữ là 7.5% (Bảng 3.1).
Bảng 3.1. Tỉ lệ bất thường NST ở các cá thể liên quan trong hiện tượng vơ sinh
Bất thường Tần số %
Nam 38/320 11.88 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Nữ 24/320 7.50
Kết quả quan sát bất thường NST cho thấy tỉ bất thường NST quan sát được trên đối tượng Nam (11.88%) cao hơn trên đối tượng Nữ (7.50%) . Ngồi ra các loại bất thường NST trên hai đối tượng cũng cĩ sự khác biệt. 4 loại bất thường NST quan sát được trên nhĩm Nam và 5 loại quan sát được trên nhĩm Nữ. Các bất thường NST được phân loại theo từng nhĩm, cĩ 5 nhĩm bất thường được ghi nhận:
bất thường số lượng, NST marker, Chuyển đoạn, đảo đoạn và biến thể chiều dài. Bất thường NST thuộc nhĩm chuyển đoạn chiếm 37.10 %, xuất hiện trên 10 đối tượng Nam và 13 đối tượng Nữ. Nhĩm đảo đoạn chiếm 11.29%, xuất hiện trên 4 Nam và 3 Nữ. Nhĩm biến thể chiều dài chiếm 46.77%, xuất hiện trên 23 đối tượng Nam và 6 đối tượng Nữ. Nhĩm bất thường số lượng chiếm 3.23 % , xuất hiện trên 1 đối tượng Nam và 1 đối tượng Nữ. Nhĩm NST marker chỉ chiếm 1.61%, xuất hiện trên 1 đối tượng Nữ (Bảng 3.2).
Bảng 3.2 Kết quả nhiễm sắc thể đồ bất thường trên hai nhĩm nam và nữ Nam Nữ Bất thường Nhiễm sắc thể đồ Tsần ố Bất thường Nhiễm sắc thể đồ Tsần ố Số lượng 46,XY/47,XXY 1 Số lượng 47,XXX 1 Nhiễm sắc thể Marker - Nhiễm sắc thể Marker 47,XX,+mar 1 Chuyển đoạn 46,XY,t(1;9)(q43;q34) 1 Chuyển đoạn 46,XX,t(2;8)(q32;q24.1) 1 46,XY,t(1;9)(p11;q12) 1 46,XX,t(2;13)(q33;q33) 1 46,XY,t(5;11)(p14;p12) 1 46,XX,t(2;20)(q35;q11.2) 1 46,XY,t(11;22)(q24;q13) 1 46,XX,t(4;17)(q12;q21) 1 46,XY,t(6;13)(q22;q21.3) 1 46,XX,t(5;10)(q35;10q) 1 46,XY,t(6;9)(q27;p12) 1 46,XX,t(5;12)(p14;q23) 1 46,XY,t(7;8)(q22;q22.4) 1 46,XX,t(5;22)(p14;p11) 1 46,XY,t(2;7)(p13;p15) 1 46,XX,t(6;11)(q15;q23) 1 45,XY,rob(14;21) 1 46,XX,t(7;10)(q22;p13) 1 46,XY,t(7;14;?) 1 46,XX,t(9;10)(q34;p15) 1 45,XX,rob(13;14) 3 Biến thể chiều dài 46,XY,9qh+ 5 Biến thể chiều dài 46,XX,9qh+ 3 46,XY,16qh+ 3 46,XY,Yqh- 9 46,XY,Yqh+ 2 46,XY,14ps+ 1 46,XY,1qh+ 3 46,XX,1qh+ 3 Đảo đoạn 46,XY,inv(9)(p12q13) 4 Đảo đoạn 46,XX,inv(9)(p12q13) 3 (Xem hình trang Phụ lục)
Các loại đột biến NST cĩ thể được phân loại theo sự bất thường NST cân bằng hoặc khơng cân bằng (bảng 3.3). Theo cách phân loại này các bất thường NST
cân bằng trên các đối tượng vơ sinh hiếm muộn khảo sát chiếm 38.71%, và bất thường NST khơng cần bằng chiếm 61.29% (Bảng 3.3).
Bảng 3.3 Phân loại nhiễm sắc thể đồ cân bằng và khơng cân bằng
Nhiễm sắc thể đồ cân bằng Nhiễm sắc thể đồ khơng cân bằng
Nhiễm sắc thể đồ Tsần ố % Nhiễm sắc thể đồ Tần số % 46,XY,t(1;9)(q43;q34) 1 0.16 47,XX,+mar 1 0.16 46,XY,t(1;9)(p11;q12) 1 0.16 45,XY,rob(14;21) 1 0.16 46,XX,t(9;10)(q34;p15) 1 0.16 45,XX,rob(13;14) 3 0.47 46,XX,t(7;10)(q22;p13) 1 0.16 46,XY,t(7;14;?) 1 0.16 46,XX,t(5;10)(q35;10q) 1 0.16 46,XY/47,XXY 1 0.16 46,XY,t(5;11)(p14;p12) 1 0.16 47,XXX 1 0.16 46,XX,t(5;12)(p14;q23) 1 0.16 46,XX,t(5;22)(p14;p11) 1 0.16 46,XY,t(2;7)(p13;p15) 1 0.16 46,XX,t(2;8)(q32;q24.1) 1 0.16 Sự đa hình 46,XX,t(2;13)(q33;q33) 1 0.16 46,XY,14ps+ 1 0.16