C- 18 ACN/ AcOH 1% 20/ 80 280 Huyết t−ơng,
322 Huyết t−ơng,
3.2.6. Định l−ợng bằng ph−ơng pháp HPLC
Q trình định l−ợng bằng HPLC có thể chia thành 4 b−ớc. Mỗi b−ớc đều có ảnh h−ởng trực tiếp đến kết quả định l−ợng. Các b−ớc này là :
− Lấy mẫu thử − Tiến hành sắc ký − Đo tín hiệu detector − Ph−ơng pháp định l−ợng
•
•
Lấy mẫu
Sai số do lấy mãu có thể tăng lên ở ít nhất 3 khâu: Lấy mẫu đại diện, bảo quản mẫu và xử lý mẫu.
để giảm sai số, việc lấy mẫu phải tôn trọng triệt để các nguyên tắc đã đ−ợc qui định đối với từng loại đối t−ợng mẫu để có thể lấy đ−ợc đại diện.
Q trình bảo quản mẫu cũng có thể dẫn đến sai số: Với mẫu thử là chất bay hơi, chất có thể phản ứng đ−ợc với hơi n−ớc hoặc khơng khí.
Các thành phần vi l−ợng có thể bị hấp phụ hoặc phản hấp phụ bởi bình chứa trong thời gian bảo quản.
Có thể tiến hành các phản ứng hố học trên mẫu thử để tạo dẫn chất có độ nhạy cao hơn để có thể đo đ−ợc bằng detector của máy. Cách này đ−ợc áp dụng đối với những chất có đáp ứng rất nhỏ hoặc hồn tồn khơng có đáp ứng với detector đo độ hấp thụ quang học.
tiến hành tách sắc ký
Quá trình chạy sắc ký cần chú ý:
Có thể xảy ra sự phân huỷ của chất thử trong khi phân tách.
Có thể xuất hiện pic lạ trên sắc đồ do dung mơi dùng hồ tan mẫu thử có chứa tạp chất. Vì vậy cần phải kiểm tra bằng sắc ký các vết tạp đó.
− Chuẩn bị mẫu thử:
Dung mơi dùng để hồ tan mẫu thử phải đ−ợc xem xét cẩn thận . Lý t−ởng nhất là dùng pha động làm dung mơi để hồ tan nó.
Trừ tr−ờng hợp mẫu thử khó tan trong dung mơi này thì phải tìm dung mơi khác thích hợp hơn.
Dung mơi phải đáp ứng các yêu cầu sau : + Độ tinh khiết cao để khơng có pic lạ,
+ Có thể hồ lẫn đ−ợc với dung môi rửa giải (pha động), + Cho đáp ứng rất nhỏ với detector,
+ Dung môi và dung dịch thử phải đ−ợc lọc qua màng lọc 0,45àm. − Tiêm mẫu: Có 2 cách tiêm mẫu vào cột:
+ Dùng bơm tiêm và
+ Van tiêm mẫu thể tích xác định.
Dùng van tiêm mẫu cho kết quả chính xác hơn (+1%) so với dùng bơm tiêm (± 1 - 2%).
Đo tín hiệu detector
Detector đ−ợc dùng phổ biến nhất trong HPLC là detector UV-Vis.
− Detector sử dụng phải đáp ứng một số yêu cầu sau : + Hoạt động đ−ợc ở vùng tuyến tính của nó,
+ Có độ hấp thụ nhỏ đối với dung môi (độ nhiễu đ−ờng nền thấp), + Tránh lọt khơng khí vào cột và detector,
+ Giữ sạch cell và làm sạch nó th−ờng xuyên. − Tín hiệu detector:
Tín hiệu detector đo đ−ợc khi chất ra khỏi cột sắc ký đ−ợc máy ghi lại d−ới dạng pic.
ở máy sắc ký cổ điển, việc đo diện tích hoặc chiều cao pic đ−ợc thực hiện bằng tay. Còn ở các máy sắc ký hiện đại việc đo đạc này đ−ợc tự động hố nhờ máy tích phân, máy tính.