C X chuẩn thêm vào
Kiểm nghiệm thuốc bằng ph−ơng pháp sinh học
4.3.3.6. Ph−ơng pháp thử
Thử vơ trùng có thể đ−ợc thực hiện theo hai ph−ơng pháp tuỳ theo tính chất của mẫu thử:
− Ph−ơng pháp lọc qua màng lọc vi khuẩn . − Ph−ơng pháp ni cấy trực tiếp.
•
•
•
Ph−ơng pháp dùng màng lọc:
Thiết bị lọc th−ờng bằng thuỷ tinh, thép không rỉ hoặc nhựa gồm hai bộ phận có thể tháo rời, ở giữa có l−ới đỡ màng lọc. Màng lọc có thành phần là nitrat celleulose th−ờng dùng lọc n−ớc, dầu, và dung dịch alcol yếu. Màng ecetat cellulose để lọc các dung dịch alcol mạnh. Lỗ màng lọc có nhiều kích th−ớc khác nhau, trong thử vơ trùng th−ờng dùng màng có đ−ờng kính khoảng 50mm và đ−ờng kính lỗ màng lọc ≤ 0,45àm.
Thiết bị lọc và màng lọc phải đ−ợc tiệt trùng tr−ớc khi thí nghiệm .
− Dung dịch chất thử chảy qua màng lọc, các vi sinh vật đ−ợc giữ lại trên màng, cấy màng lọc vào các môi tr−ờng thích hợp để phát hiện vi khuẩn, vi nấm.
− Ph−ơng pháp màng lọc kiểm nghiệm đ−ợc các th−ốc có tác dụng ức chế vi sinh vật, đặc biệt là thuốc kháng sinh, nh−ng đòi hỏi thiết bị tốt và điều kiện vô trùng cao.
Ph−ơng pháp nuôi cấy trực tiếp:
Ph−ơng pháp ni cấy trực tiếp có kỹ thuật đơn giản, nh−ng khả năng phát hiện vi sinh vật giảm khi số l−ợng vi sinh vật có ít và phân phối trong một thể tích chất thử lớn. Ph−ơng pháp này không thực hiện đ−ợc với các chế phẩm có tác dụng ức chế và các chất kháng sinh, vì khi thí nghiệm chất thử đ−ợc cấy trực tiếp vào các mơi tr−ờng ni cấy thích hợp cho các vi khuẩn, vi nấm.
L−ợng mẫu thử dùng trong thí nghiệm:
L−ợng mẫu thử cần cấy vào các môi tr−ờng tuỳ thuộc vào từng loại mẫu (bảng 4.1.).
− Chất lỏng là dầu hay dung dịch dầu phải thêm vào môi tr−ờng nuôi cấy 1% tween 80 hoặc các chất nhũ hố khác với nồng độ thích hợp.
− Mẫu thử là dạng mỡ hay kem đ−ợc hồ lỗng vào dung dịch pepton 0,1% vô trùng theo tỷ lệ 1/10 tr−ớc khi cấy vào môi tr−ờng, (dung dịch pepton, cần thêm tween 80 với tỷ lệ 1ml/ 1lít).
Kỹ thuật thử:
•
− Mẫu thử là d−ợc phẩm:
Dùng dụng cụ vô trùng cấy trực tiếp chế phẩm thử vào các môi tr−ờng phát hiện vi khuẩn, vi nấm theo số l−ợng quy định. Chất rắn là dạng bột có thể cho trực tiếp vào môi tr−ờng hoặc làm thành dung dịch hay nhũ dịch 1% sau đó cấy vào mơi tr−ờng.
Bảng 4.1. L−ợng mẫu thử dùng cho thí nghiệm ni cấy trực tiếp
L−ợng chế phẩm trong một đơn vị đóng gói
L−ợng tối thiểu cho một mơi tr−ờng ni cấy
Thể tích mơi tr−ờng (ml) - Chất lỏng: Thể tích V < 1ml 1 ml ≤ V< 4 ml 4 ml ≤ V < 20ml 20ml ≤ V < 50ml 50ml ≤ V< 100ml V ≥ 100ml - Chất rắn: Khối l−ợng P< 50mg 50mg < P< 200mg P ≥ 200mg Toàn bộ một ống 1/2 ống 2ml 5ml 10ml Th−ờng 10% Tồn bộ một đơn vị đóng gói 1/2 khối l−ợng của một đơn vị đóng gói 100mg 10 15 20 40 80 100 20 40 80
− Mẫu thử là băng gạc, chỉ khâu phẫu thuật nếu kích th−ớc và hình dạng cho phép, nhúng tồn bộ mẫu thử vào 100ml mơi tr−ờng.
− Mẫu thử là dây truyền dịch: Cho dung dịch pepton 0,1% vơ trùng chảy qua để thu đ−ợc ít nhất 15ml và cấy vào 100ml môi tr−ờng.
Môi tr−ờng phát hiện vi khuẩn đ−ợc nuôi cấy ở 30 - 35oC ít nhất trong 4 ngày, và ở 25 - 28oC ít nhất trong 7 ngày đối với vi nấm.
(Mỗi loại môi tr−ờng làm 2 - 3 ống thử song song).
• Nhận định kết quả:
Mẫu thử đ−ợc coi là vô trùng nếu sau thời gian ni cấy khơng có vi khuẩn, vi nấm phát triển.
Nếu có 1 hoặc nhiều ống có vi sinh vật mọc cần làm lại lần thứ hai (Tr−ớc khi làm lại thử nghiệm lần 2 cần phân lập xác định đặc tính hình thái của vi sinh vật ở các ống thử d−ơng tính):
− Nếu khơng có vi sinh vật → mẫu vơ trùng.
− Nếu có vi sinh vật giống với lần một → mẫu thử không vô trùng.
− Nếu có vi sinh vật khác với lần một → thí nghiệm đ−ợc làm lại lần 3 với số l−ợng mẫu gấp đơi:
+ Khơng có vi sinh vật phát triển → mẫu vô trùng. + Có vi sinh vật mọc → mẫu khơng vơ trùng.