C X chuẩn thêm vào
Kiểm nghiệm thuốc bằng ph−ơng pháp sinh học
4.3.4. Thử giới hạn vi sinh vật
Các d−ợc phẩm trong quá trình sản xuất th−ờng bị nhiễm vi khuẩn, vi nấm do các nguyên nhân nh−:
− Do bản chất nguyên liệu, nếu nguyên liệu có nguồn gốc từ động vật, thực vật thì mức độ nhiễm khuẩn cao hơn nhiều so với các hoá chất. − Các tá d−ợc nh− tinh bột, đ−ờng, mật là môi tr−ờng chứa nhiều vi sinh
vật, vì vậy dễ gây nhiễm bẩn cho thuốc.
− Cơ sở sản xuất, trang thiết bị, bao bì đóng gói, ng−ời sản xuất cũng là nguyên nhân gây nhiễm khuẩn.
− Dạng bào chế nh− viên hồn mềm có độ ẩm cao th−ờng tạo điều kiện cho vi sinh vật phát triển hơn viên nén, viên hồn cứng.
Vì vậy, thử giới hạn vi sinh vật là một thử nghiệm bắt buộc cho các d−ợc phẩm từ nguyên liệu đến thành phẩm khơng đ−ợc tiệt trùng trong q trình sản xuất.
4.3.4.1. Mục đích
Thử độ nhiễm vi sinh vật nhằm mục đích xác định giới hạn tối đa của số l−ợng vi khuẩn hiếu khí, vi nấm có trong 1g (hoặc 1ml) chế phẩm thử. Đồng thời phát hiện các vi khuẩn chỉ điểm vệ sinh quy định khơng đ−ợc có trong thuốc là:
Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, các
lồi Salmonella, vi khuẩn kỵ khí Clostridia.
4.3.4.2. Nguyên tắc
Phép thử đ−ợc dựa trên nguyên tắc:
Đếm số vi khuẩn hiếu khí, nấm mốc, nấm men có trong d−ợc phẩm đ−ợc thể hiện bằng các khuẩn lạc đặc tr−ng trên đĩa thạch dinh d−ỡng thích hợp. Căn cứ vào các đặc tính hình thái, sinh lý, sinh hố của từng loại vi khuẩn để xác định vi khuẩn gây bệnh. Trên cơ sở kết quả thí nghiệm đánh giá chất l−ợng của thuốc theo tiêu chuẩn d−ợc điển hoặc tiêu chuẩn cơ sở.
4.3.4.3. Ph−ơng pháp thử
•
•
•
Mơi tr−ờng:
Đa số các d−ợc điển th−ờng dùng môi tr−ờng thạch casein đậu t−ơng để đếm vi khuẩn hiếu khí, mơi tr−ờng thạch Sabouraud - kháng sinh để đếm vi nấm. Cũng có thể dùng mơi tr−ờng thạch th−ờng để thử vi khuẩn hiếu khí vì mơi tr−ờng này rất thích hợp cho sự phát triển của đa số vi khuẩn hiếu khí (theo D−ợc điển Trung Quốc 1997)
Chuẩn bị mẫu thử:
Mẫu thử theo quy định chung đ−ợc lấy 10g (hoặc 10 ml) để thí nghiệm. − Mẫu thử là chất rắn hay chất lỏng có thể làm thành dung dịch hay nhũ
dịch trong n−ớc, đ−ợc pha loãng vào dung dịch đệm phosphat pH =7,2 hoặc dung dịch NaCl 0,9% để đ−ợc nồng độ 10-1 sau đó pha các nồng độ tiếp theo 10-2, 10-3 … tuỳ theo yêu cầu thí nghiệm.
− Mẫu thử là chất lỏng khơng hồ lẫn vào n−ớc nh− dạng dầu, kem, hoặc thuốc mỡ. Cần chế tạo nhũ dịch bằng cách thêm một l−ợng chất nhũ hố vơ trùng thích hợp nh− tween 20, tween 80, làm nóng nhẹ 45oC để tạo một nhũ dịch đồng nhất.
Kiểm tra chất ức chế:
Kết quả thí nghiệm sẽ khơng có giá trị nếu trong mẫu thử có chất bảo quản hoặc các thành phần có ảnh h−ởng đến sự phát triển của vi sinh vật. Vì vậy, cần kiểm tra chất ức chế tr−ớc khi đếm số l−ợng vi sinh vật.
− Vi sinh vật chỉ thị:
Staphylococcus aureus (đại diện vi khuẩn G +). Escherichia coli (đại diện vi khuẩn G -).
Candida albicans (đại diện vi nấm).
Các chủng trên đ−ợc nuôi cấy trong các mơi tr−ờng dinh d−ỡng thích hợp sau 18 - 24 giờ (đối với vi khuẩn) và 24 đến 48 giờ đối với vi nấm, đ−ợc làm thành nhũ dịch có khoảng 100 tế bào/ ml.
− Cách tiến hành:
Đĩa thử 1: Cho 1ml chất thử ở nồng độ thích hợp. Đĩa thử 2: 1 ml chất thử + 1ml nhũ dịch vi sinh vật.
Đĩa chứng: 1ml n−ớc cất vô trùng + 1ml nhũ dịch vi sinh vật
Cho vào mỗi đĩa 15 - 20 ml môi tr−ờng dinh d−ỡng thích hợp đã để nguội d−ới 45oC.
ủ 30 - 35oC/ 24 - 48 giờ đối với vi khuẩn và 25 - 28oC/48 - 72 giờ đối với C. albicans.
− Nhận xét kết quả:
Đếm số khuẩn lạc vi sinh vật trên các đĩa thí nghiệm. Gọi A là số khuẩn lạc ở đĩa 1
Gọi B là số khuẩn lạc ở đĩa 2 Gọi C là số khuẩn lạc ở đĩa chứng
Nếu B ≈ A + C → mẫu thử khơng có chất ức chế.
Nếu B ≈ A hoặc B << A + C → mẫu thử có chất ức chế vi sinh vật. Chất ức chế phải đ−ợc xử lý bằng cách tăng thể tích mơi tr−ờng, trung hồ chất ức chế bằng các chất trung hồ thích hợp nh− tween 20 4%. Nếu mẫu có chất ức chế quá mạnh phải thử bằng ph−ơng pháp màng lọc.
* Kiểm tra chất ức chế cũng có thể đ−ợc thực hiện theo cách sau:
Cấy khoảng 100 tế bào các vi khuẩn vào các ống mơi tr−ờng chọn lọc khơng có mẫu thử và có mẫu thử ở nồng độ thích hợp cho E. coli Salmonella,
Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa.
Mẫu thử khơng có tác dụng ức chế nếu vi khuẩn mọc tốt nh− nhau ở cả hai ống môi tr−ờng.
Đếm số l−ợng vi sinh vật:
•
•
− Đối với vi khuẩn:
Cho vào mỗi đĩa petri 1ml chất thử ở nồng độ thích hợp sao cho khơng q 300 khuẩn lạc trong 1ml. Thêm 15 - 20ml môi tr−ờng thạch casein - đậu t−ơng hoặc môi tr−ờng thạch th−ờng đã để nguội d−ới 45oC, xoay nhẹ đĩa để chất thử trộn đều vào môi tr−ờng. Nuôi cấy 30 - 350C trong 1 - 2 ngày. − Đối với vi nấm:
Cho vào mỗi đĩa petri 1ml chất thử ở nồng độ thích hợp sao cho không quá 100 khuẩn lạc vi nấm trong 1ml. Thêm 15-20ml thạch Sabouraud + kháng sinh.
− Nuôi cấy 25 - 28oC trong 4 - 5 ngày.
− Thí nghiệm đ−ợc thực hiện với 1 hay 2 nồng độ pha loãng cuối cùng. Mỗi nồng độ đ−ợc làm 2 - 3 đĩa thử để lấy giá trị trung bình. Sau thời gian ni cấy, các đĩa có số khuẩn lạc vi khuẩn nhỏ hơn 300 và vi nấm nhỏ hơn 100 đ−ợc đếm để tính số l−ợng.
Tính kết quả:
Tổng số vi khuẩn hiếu khí, vi nấm trong 1g (1ml) đ−ợc tính theo cơng thức:
2 k k A k A X 1 1 + 2 2 = (Phép thử thực hiện với 2 nồng độ).
A1 : Số khuẩn lạc vi sinh vật trung bình ở nồng độ pha lỗng k1. A2 : Số khuẩn lạc vi sinh vật trung bình ở nồng độ pha loãng k2. k1, k2 : Độ pha lỗng.
Các d−ợc điển có quy định: mẫu thử có ít hơn 10 vi sinh vật/1g (1ml) nếu khơng có khuẩn lạc mọc trên đĩa thử ở nồng độ 10-1.