CHƯƠNG 3 : KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
3.2. Hoạt tính chống oxy hóa của cao trích
3.2.1. Tổng hàm lượng polyphenol
Tổng hàm lượng polyphenol của 4 loại cao trích Huỳnh Anh được xác định bằng phương pháp so màu dùng thuốc thử Folin-Ciocalteu. Kết quả được trình bày trong Bảng 3.2 dựa theo kết quả đo ở phụ lục.
40
Bảng 3.2. Tổng hàm lượng phenolic trong các mẫu cao (mg GAE/g cao khô)
STT Mẫu Tổng hàm lượng polyphenol
mg GAE/g cao khô
1 E-TH 17,14 ± 0,87a
2 E-HH 26,27 ± 2,04b
3 E-RH 35,63 ± 2,95c
4 E-LH 51,38 ± 2,90d
Dữ liệu được thể hiện dưới dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn (n=3). Các giá trị trung bình với các chữ cái khác nhau (a-d) thể hiện sự khác biệt đáng kể (p < 0,05) về tổng hàm lượng polyphenol của các mẫu cao theo kiểm định Ducan
Kết quả cho thấy tổng hàm lượng polyphenol giữa các mẫu có sự khác biệt đáng kể (p < 0,05). Nhìn chung, tổng hàm lượng polyphenol dao động trong khoảng 17,14 - 51,38 mgGAE/g. Trong đó, mẫu E-LH có hàm lượng polyphenol cao nhất (51,38 mgGAE/g), tiếp theo là E-RH (35,63 mgGAE/g), E-HH (26,27 mgGAE/g) và mẫu E-TH có hàm lượng polyphenol thấp nhất (17,14 mgGAE/g). Sự khác biệt này là do các hợp chất phenolic phân bố không đồng đều ở mô, tế bào và cấp độ dưới mức tế bào (Naczk và Sandi, 2004). Ngoài ra, hàm lượng phenolic cịn thay đổi theo vị trí các bộ phận của cây và điều kiện trồng trọt (Nirmal và Benjakul, 2011), điều kiện trích ly cao như nhiệt độ, thời gian và dung môi sử dụng (Liu, F.F et al., 2000). Một số hợp chất khử không phải là hợp chất phenolic như axit hữu cơ và đường có thể làm tăng kết quả tổng hàm lượng polyphenol, nhưng một số flavonoid có thể có hiệu quả ngược lại. Kết quả định lượng phenolic chủ yếu được tìm thấy trong Huỳnh Anh gồm có Epicatechin (87,39 mg GAE/100g), Gallic acid (106,02 mg GAE/100g) và Protocatechuic acid (133,81 mg GAE/100g) (Li,An.N và cộng sự, 2014).
Khi sử dụng methanol làm dung môi, nghiên cứu của Rehan và cộng sự (2013) chỉ ra hàm lượng polyphenol của lá Huỳnh Anh là 30,56 mg GAE/g, nghiên cứu của Agbo và cộng sự (2015) cho thấy hàm lượng polyphenol được tìm thấy trong lá là 53,35 mg GAE/g và thân là 38,78 mg GAE/g. Nghiên cứu của Rashmi Das và cộng sự (2017) cũng thể hiện tổng hàm lượng polyphenol khác nhau của lá Huỳnh Anh khi sử dụng dung môi acetone, chloroform,
41
hexane, methanol. Tuy nhiên, kết quả này có sự khác biệt so với hàm lượng polyphenol của E- LH và E-TH khi sử dụng ethanol làm dung môi. Nguyên nhân là do độ phân cực của dung môi khác nhau dẫn đến khả năng hịa tan các chất tan vào dung mơi khác nhau (Wang, Pan, Ma & Atungulu, 2011).
Phương pháp so màu Folin – Ciocalteu là thước đo hàm lượng polyphenol dễ thực hiện, có thể được lặp lại nhiều lần và được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu chất kháng oxi hóa. Hàm lượng polyphenol thể hiện khả năng chống oxi hóa cao vì các hợp chất phenolic có tác dụng ức chế gốc tự do. Tuy nhiên, kết quả có thể bị ảnh hưởng bởi chất nền có trong mẫu, sự ức chế do chất oxy hóa cạnh tranh với thuốc thử hoặc q trình oxy hóa khơng khí sau khi mẫu được tạo kiềm (Agbo và cộng sự, 2015), (Singleton và cộng sự, 1965).
3.2.2. Hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH
Để xác định khả năng bắt gốc tự do DPPH, các mẫu cao được pha loãng thành dãy nồng độ 10, 25, 50, 100 µg/ml. Chứng dương sử dụng là acid gallic. Kết quả ghi nhận được về tỉ lệ % hoạt tính bắt gốc tự do DPPH của các cao chiết được minh họa theo Bảng 3.3.
Bảng 3.3. Phần trăm ức chế gốc tự do DPPH của các mẫu cao
Mẫu % Ức chế theo nồng độ IC50 (µg/mL) 10 µg/mL 25 µg/mL 50 µg/mL 100 µg/mL E-RH 3,90 ± 5,15hi 7,08 ± 2,61h 17,75 ± 3,04def 36,87 ± 0,67b >100 E-TH 6,67 ± 2,94h 7,56 ± 2,93h 16,99 ± 2,73ef 21,74 ± 5,86d >100 E-LH 0,29 ± 1,28hi 10,92 ± 0,80fg 29,36 ± 3,27c 60,29 ± 3,55a 83,48 E-HH 0,18 ± 2,51h 5,58 ± 2,44g 18,38 ± 2,59de 29,66 ± 1,75bc >100
Dữ liệu được thể hiện dưới dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn (n = 3). Các trung bình với chữ cái khác nhau (a-i) ở cùng một cột thể hiện sự khác biệt đáng kể (p < 0,05) về phần trăm ức chế gốc tự do DPPH của các mẫu cao theo kiểm định Ducan.
Kết quả thu được cho thấy phần trăm ức chế của các mẫu cao tỷ lệ thuận với nồng độ, có nghĩa là khả năng kháng gốc tự do tăng lên khi nồng độ của các mẫu cao tăng. Trong đó, có 3 mẫu (E-RH, E-TH, E-LH) hoạt tính yếu với giá trị IC50 > 100 µg/mL và mẫu E-LH có IC50 là 83,48µg/mL. Hơn nữa, chất đối chứng dương axit gallic giá trị IC50 = 5,62 µg/mL được xem là một chất chống oxy hóa mạnh hơn tất cả các mẫu cao trích từ Huỳnh Anh (Bảng 3.4).
42
Bảng 3.4. Phần trăm ức chế và giá trị IC50 của chất đối chứng dương
Mẫu Phần trăm ức chế (I%) IC50
(µg/mL)
10(µg/mL) 5(µg/mL) 2,5(µg/mL) 1(µg/mL)
Axit gallic 70,18 ± 1,10 52,46 ± 0,80 34,56 ± 1,84 20,35 ± 0,80 5,62
Theo kết quả của Wong và cộng sự (2013) khi nghiên của các mẫu cao trích từ rễ, thân, lá, hoa cây Huỳnh Anh thì hoạt tính khử gốc tự do DPPH của mẫu lá là cao nhất và của rễ là thấp nhất. Nghiên cứu chỉ ra khả năng bắt gốc tự do thay đổi theo điều kiện môi trường, điều kiện sinh trưởng của cây ở những điều kiện thổ nhưỡng, khí hậu. Ngồi ra, khi nghiên cứu sự tương quan giữa năng lực chống oxy hoá và tổng hàm lượng phenolic trong các mẫu thử thì giá trị DPPH có mối tương quan với tổng hàm lượng phenol ở các bộ phận của cây Huỳnh Anh. Cụ thể, tổng hàm lượng polyphenol và giá trị DPPH của rễ, thân, lá, hoa có sự tương quan với hệ số r = 0,952. Trong nghiên cứu này, mẫu cao có hàm lượng tổng polyphenol cao nhất là E-LH trong khi đó, mẫu có hoạt tính ức chế DPPH cao nhất cũng là E-LH. Như vậy, so với các nghiên cứu đề cập ở trên, kết quả thu được trong nghiên cứu này có sự tương đồng.
3.2.3. Năng lực khử của cao trích
Bảng 3.5. Độ hấp thu của các mẫu cao tại bước sóng 700nm
Thơng số kết quả về độ hấp thu ở các nồng độ khác nhau của các mẫu cao trong thí nghiệm về xác định khả năng khử bằng potassium ferricyanide được trình bày như trong Bảng
3.5. Bảng 3.5 cho thấy tất cả mẫu cao trích đều có khả năng khử Fe3+ thành Fe2+. Nhìn chung, giá trị mật độ quang của các mẫu đều tăng khi tăng nồng độ (p < 0,05). So sánh khả năng khử
Mẫu Độ hấp thu (A) tại các nồng độ EC50
(mg/mL) 0,1 (mg/mL) 0,5 (mg/mL) 1,0 (mg/mL) E-RH 0,034 ± 0,043a 0,391 ± 0,032b 0,654 ± 0,034de 0,77 E-TH 0,014 ± 0,009a 0,309 ± 0,062b 0,593 ± 0,040cd 2,67 E-LH 0,118 ± 0,033a 0,697 ± 0,026ef 1,281 ± 0,048g 1,66 E-HH 0,062 ± 0,028a 0,510 ± 0,108c 0,775 ± 0,111f 2,14
Dữ liệu được thể hiện dưới dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn (n = 3). Các trung bình với chữ cái khác nhau (a-g) ở cùng một cột thể hiện sự khác biệt đáng kể (p < 0,05) về phần trăm năng lực khử của các mẫu cao theo kiểm định Ducan
43
giữa các mẫu tại nồng độ 0,1; 0,5; 1 mg/mL cho thấy 4 loại cao trích đều có năng lực khử thấp hơn vitamin C. Điều này phù hợp với kết quả nghiên cứu trước đây (Mannan et al., 2017) và tương quan với kết quả của phương pháp xác định tổng hàm lượng polyphenol với hệ số r = 0,838. Kết quả cho thấy mẫu có hoạt tính mạnh nhất là mẫu E-RH với giá trị EC50 là 0,77 mg/mL, tiếp theo là mẫu E-LH, E-HH, E-TH với các giá trị EC50 lần lượt là 1,66; 2,14; 2,67 mg/mL.
Thành phần của lá Huỳnh Anh có chứa diệp lục, nên trở thành mối quan tâm trong việc xác định năng lực khử. Tuy nhiên, nghiên cứu của Nilesh và Benjakul (2011) chỉ ra độ hấp thu giữa các mẫu đã loại diệp lục và không loại diệp lục tương đương nhau, nên việc loại bỏ chất diệp lục khơng có tác động làm giảm năng lực khử của mẫu. Farhoosh và cộng sự (2007) khi nghiên cứu dung mơi trích ly có ảnh hưởng đến năng lực khử đã nhận thấy rằng, dịch trích ethyl acetate của trà xanh có khả năng khử lớn hơn so với dịch trích từ nước và metanol. Kết quả này cho thấy rằng tất cả các chất chiết xuất đều có khả năng cho điện tử. Những chất chiết xuất này có thể được sử dụng để giảm hắc tố bằng cách giảm chuyển hóa DOPA-quinone thành DOPA. Do đó, quinone khơng thể tiếp tục chuyển đổi thành sắc tố nâu và melanosis có thể bị chậm phát triển. (Roedig-Penman & Gordon, 1997; Negi et al., 2005)
3.2.4. Hoạt tính ức chế enzyme PPO
Hoạt tính ức chế PPO của các mẫu cao chiết được biểu diễn bằng phần trăm ức chế trình bày trong Bảng 3.6. Ở nồng độ 100 µg/mL, mẫu E-RH thể hiện hoạt tính ức chế PPO cao hơn đáng kể so với các mẫu (ức chế 44,96% PPO), mẫu E-LH cũng có khả năng ức chế PPO tương đương (ức chế 42,30% PPO) (p < 0,05). Mẫu có hoạt tính ức chế thấp nhất là E- HH ức chế 9,19% ở nồng độ 100 µg/mL. Kết quả này cho thấy các mẫu cao đều có khả năng ức chế enzyme tyrosinase với hoạt tính ức chế tăng theo chiều tăng nồng độ. Điều này phù hợp với nghiên cứu của Soysal (2008) về khả năng ức chế của cao trích trà xanh đối với PPO của táo tăng lên khi tăng nồng độ cao trích. Ngồi ra, Nirmal và cộng sự (2009) cũng kết luận hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase tăng theo nồng độ khi sử dụng trực tiếp catechin trích từ trà xanh để bảo quản tơm. Kết quả này cũng phù hợp với kết quả xác định tổng hàm lượng polyphenol với hệ số tương quan r = 0,643.
44
Bảng 3.6. Phần trăm ức chế enzyme PPO của các mẫu cao
Mẫu % Ức chế enzyme PPO IC50
(µg/mL) 5 µg/mL 10 µg/mL 25 µg/mL 50 µg/mL 100 µg/mL E-RH 10,84 ± 5,05ab 11,84 ± 13,88ab 17,29 ± 0,20ab 25,28 ± 4,05bc 44,96 ± 0,11d >100 E-TH 3,33 ± 0,37a 3,53 ± 12,56a 9,54 ± 18,95ab 12,20 ± 24,10ab 25,28 ± 4,05bc >100 E-LH 4,85 ± 0,71a 5,59 ± 0,14a 8,76 ± 0,31ab 14,35 ± 0,37ab 42,30 ± 0,22cd >100 E-HH 1,11 ± 6,55a 4,71 ± 4,08a 5,70 ± 21,65a 6,32 ± 4,51ab 9,19 ± 10,78ab >100
Dữ liệu được thể hiện dưới dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn (n = 3). Các trung bình với chữ cái khác nhau (a-d) ở cùng một cột thể hiện sự khác biệt đáng kể (p < 0,05) về phần trăm năng lực khử của các mẫu cao theo kiểm định Ducan.
Theo nghiên cứu của Donghyun và cộng sự (2006) khả năng ức chế PPO của các cao trích có thể được lý giải là do trong dịch chiết chứa các polyphenol, đặc biệt các flavonoid có trong mẫu cao, những chất này có khả năng tạo phức hợp với đồng trong trung tâm hoạt động của PPO. Nhóm hydroxyl có thể tham gia khử DOPA-chrome thành DOPA bằng cách nhường electron hoặc tạo liên kết ngang với PPO qua liên kết hydro. Đối với acid carboxylic có chứa vịng thơm có thể ức chế PPO bằng cách hoạt động như một chất ức chế cạnh tranh do có cấu trúc tương đồng với các hợp chất polyphenol. Vì vậy, chúng có khả năng ức chế PPO. Tuy nhiên, các giá trị IC50 của các mẫu đều cao hơn 100 μg/mL, cho thấy các mẫu cao trích có hoạt tính ức chế PPO khơng bằng axit kojic (31,73 µg/ml).
Ở thí nghiệm này cho thấy mẫu E-RH có hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase mạnh hơn E-LH nhưng khơng có sự chênh lệch đáng kể giữa hai mẫu. Thơng qua các thí nghiệm khảo sát hàm lượng polyphenol, hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH, năng lực khử của cao trích đều cho thấy hoạt tính của E-LH là tốt nhất. Nghiên cứu của Coppen và cộng sự (1983) chỉ rõ trong rễ Huỳnh Anh có chứa một số thành phần đã được phân lập và xác định thuộc chuỗi iridoid lactone như allamadin, allamandicin và fluvoplumierin. Ngoài ra, lá là bộ phận mọc trên thân, việc thu hái để sử dụng thuận tiện và dễ dàng hơn so với rễ. Từ những gì đã phân tích về thành phần cũng như tính khả thi trong việc sử dụng, nhóm đã lựa chọn bộ phận lá Huỳnh Anh để tiến hành điều chế cao bảo quản tôm.