CHƯƠNG 2 : THỰC NGHIỆM
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Phương pháp xác định tổng hàm lượng polyphenol
Nguyên tắc: Các mẫu cao được chiết bằng methanol 70% (MeOH) ở nhiệt độ 70oC. Các polyphenol trong cao chiết sẽ được xác định bằng phương pháp so màu thuốc thử Folin- Ciocalteu. Thuốc thử này chứa chất oxy hóa là axit phospho-vonframic. Các nhóm hydroxy phenol dễ bị oxy hóa trong q trình khử sinh ra màu xanh có độ hấp thu cực đại ở bước sóng 765 nm. Phản ứng này là do sự hình thành màu xanh của vonfarm và molypden. Thuốc thử Folin-Ciocalteu phản ứng với nhiều hợp chất polyphenol và các hợp chất đơn lẻ khác nhau, việc lựa chọn axit gallic làm chất chuẩn hiệu chuẩn cũng giúp ích cho việc thu được dữ liệu polyphenol tổng (TCVN 9745-1: 2013).
29
Hình 2.3. Quy trình xác định tổng polyphenol Thuyết minh quy trình Thuyết minh quy trình
Tổng hàm lượng polyphenol được xác định theo TCVN 9745-1: 2013 có thêm một số hiệu chỉnh. Hịa tan 0,2g cao trích vào 10ml MeOH 70% ở 70oC rồi đun nóng 10 phút, lắc đều 5 phút. Quá trình này được tiến hành 2 lần. Dung dịch sau đó được li tâm 3500 vòng trong 10 phút hoặc sử dụng giấy lọc tinh để loại bỏ hết phần cặn cịn sót lại. Từ dịch chiết này, tiếp tục pha loãng với hệ số F thích hợp.
Cao trích Đun nóng 70oC Hịa tan Lắc đều MeOH 70% (nếu có) Li tâm/lọc Lắc đều Ủ tối 30 phút Để yên 3 – 8 phút Đo UV-VIS 760 nm Na2CO3 10% (nếu có) Thuốc thử Folin 20% Hút dịch chiết
30
Dung dịch mẫu sau pha loãng được dùng để thực hiện đo UV- Vis. Hút 1,3 ml dịch mẫu cho vào ống thủy tinh rồi thêm 1 mL thuốc thử Folin 20% và lắc đều. Để yên dung dịch trong khoảng 3-8 phút rồi thêm 700 μL dung dịch Na2CO3 10%, ủ tối dung dịch trong 30 phút ở nhiệt độ phịng. Sau đó, rót dung dịch vào cuvet 1 cm và thực hiện đo mật độ quang với bước sóng 760 nm. Mỗi mẫu đo lặp lại 3 lần. Tổng hàm lượng polyphenol được tính tốn bằng cách quy về lượng tương đương với chất chuẩn axit galic, được biểu diễn theo số mg GAE/g cao.
Cơng thức tính hàm lượng polyphenol trong mẫu cao trích
(2.2)
Trong đó:
X : Hàm lượng tổng polyphenol trong mẫu quy về lượng tương đương với chất chuẩn axit gallic (mg GAE/g cao khơ)
C : Nồng độ polyphenol tính từ đường chuẩn (mg/L) F : hệ số pha loãng (từ dung dịch đã chiết 10mL) m : khối lượng cân của mẫu cao trích (g)
%H : Độ ẩm trong cao trích