CHƯƠNG 2 : THỰC NGHIỆM
2.1. Nguyên liệu, hóa chất và dụng cụ
2.1.3. Dụng cụ, thiết bị
Bảng 2.2. Danh sách dụng cụ, thiết bị sử dụng
Tên dụng cụ, thiết bị Nguồn gốc
Bể điều nhiệt Bể rung siêu âm
Các dụng cụ thí nghiệm cơ bản Cân phân tích 2 số
Cân phân tích 4 số Máy quang phổ UV-VIS Máy ảnh
pH kế Tủ sấy
Thiết bị cô quay Thiết bị đồng hóa Thiết bị li tâm
Memmert - Đức
Elma Ultrasonic units - Đức Duran - Đức
Presisa - Thụy Sĩ Sartorius - Đức Dynamica- Thụy Sĩ Canon - Nhật Bản Mettler Toledo – USA Memmert – Đức Yamato – Nhật Bản IKA- Đức
Hermle – Đức
2.2. Nội dung nghiên cứu 2.2.1. Sơ đồ nghiên cứu 2.2.1. Sơ đồ nghiên cứu
22
Hình 2.1. Sơ đồ nghiên cứu
Xác định tổng hàm lượng polyphenol Xác định chỉ số melanosis Xác định sự thay đổi pH Xác định chỉ số oxy hóa thiobarbituric acid (TBARS) Xác định chỉ tiêu vi sinh Xác định hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH Xác định hoạt tính khử Xác định khả năng ức chế tyrosinase Thực hiện HPLC-MS Xử lí sơ bộ nguyên liệu Trích ly bằng ethanol Nguyên liệu Điều chế cao trích Sàng lọc hoạt tính kháng oxy hóa Thử hoạt tính ức chế tyrosinase của cao
Phân tích thành phần hóa học Ứng dụng bảo quản tơm Giai đoạn 1 Điều chế cao trích Giai đoạn 3 Ứng dụng bảo quản tôm Giai đoạn 2 Sàng lọc hoạt tính sinh học và phân tích thành phần hóa học
23
Thuyết minh sơ đồ
Tại giai đoạn 1, các bộ phận của cây Huỳnh Anh (rễ, thân, lá, hoa) được thu nhận, xử lí sơ bộ, loại bỏ phần hư hỏng sau đó được sấy và nghiền thành bột. Bột được ngâm dầm trong ethanol 96oC, mỗi lần ngâm kéo dài 24 giờ. Dung dịch sau khi lọc được chứa trong các bình tối màu cho đến khi kết thúc q trình ngâm dầm. Sau đó, dung dịch được cô quay để loại bỏ dung môi và thành phẩm được sấy khơ đến khối lượng khơng đổi tạo thành cao trích. Cao trích được chứa trong các hũ tối màu và bảo quản ở nhiệt độ 4oC.
Trong giai đoạn 2, các mẫu cao được sàng lọc hoạt tính kháng oxy hóa bằng các phương pháp xác định hàm lượng tổng polyphenol, khả năng nhặt gốc tự do DPPH, hoạt tính khử. Sau đó, các mẫu cao cũng được sàng lọc hoạt tính ức chế tyrosinase. Dựa vào các kết quả trên lựa chọn mẫu cao có hoạt tính tốt nhất và phân tích thành phần hóa học bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao kết hợp ghép khối phổ (HPLC-MS).
Tại giai đoạn 3, mẫu cao có hoạt tính tốt nhất được ứng dụng bảo quản tơm. Mẫu tơm trong q trình bảo quản được thực hiện đánh giá chỉ số melanosis, sự thay đổi pH, chỉ số oxy hóa axit thiobarbituric (TBARS), chỉ tiêu vi sinh và tổng hàm lượng nito bazo bay hơi.
2.2.2. Điều chế cao trích
Mục tiêu: sử dụng các bộ phận rễ, thân, lá hoa của cây Huỳnh Anh (Allamanda
Cathartica L.) tạo thành cao trích bằng phương pháp ngâm dầm. Xác định độ ẩm và hiệu suất
24
Hình 2.2. Sơ đồ điều chế cao trích Thuyết minh sơ đồ Thuyết minh sơ đồ
Các bộ phận của cây Huỳnh Anh như rễ, thân, lá và hoa tươi được thu nhận, xử lí sơ bộ rồi đem đi sấy khô, nghiền nhỏ thành bột. Bột sẽ được ngâm EtOH 96o với tỷ lệ 1:1,5 (w/v) trong 24 giờ và tiến hành lọc thơ thu dung dịch. Q trình ngâm dầm được thực hiện lặp
Nguyên liệu Sấy khô Nghiền nhỏ Lọc thô Ngâm Cao khơ EtOH 96o (nếu có) Lọc tinh Cơ quay Sấy khơ Bã Bã
25
lại 3 lần. Phần dịch lọc của mỗi bộ phận được bảo quản trong các bình thủy tinh tối màu cho đến khi kết thúc q trình ngâm. Dung dịch sau đó được lọc qua giấy lọc để loại bỏ các mảnh vụn cịn sót lại. Dung dịch được cô quay ở nhiệt độ 50oC, tốc độ 100 vịng/phút. Dịch sau cơ quay được chứa trong hũ thủy tinh tối màu đã xác định khối lượng, sau đó sấy ở nhiệt độ 55oC đến khối lượng khơng đổi. Cao thành phẩm được bảo quản ở nhiệt độ 4oC khi không sử dụng, các mẫu cao được mã hóa theo Bảng 2.3.
Cơng thức tính hiệu suất cao trích:
100 . bơt cao m m H = (2.1) Trong đó:
- mcao: Khối lượng cao thu được (g) - mbột: Khối lượng bột ban đầu (g)
Bảng 2.2. Mã hóa mẫu
STT Ký hiệu Tên mẫu
1 E-RH Rễ Huỳnh Anh
2 E-TH Thân Huỳnh Anh
3 E-LH Lá Huỳnh Anh
4 E-HH Hoa Huỳnh Anh
Địa điểm thực hiện: Phịng thí nghiệm Cơng nghệ cao, trường Đại học Sư phạm Kỹ thuật Tp.HCM.
2.2.3. Sàng lọc hoạt tính chống oxy hóa
Mục tiêu: xác định khả năng chống oxy hóa của 4 loại cao trích bằng phương pháp xác định tổng hàm lượng polyphenol, hoạt tính ức chế gốc tự do (DPPH), khả năng khử Fe3+. Dựa vào kết quả chọn ra loại cao trích có hoạt tính tốt nhất ứng dụng vào q trình bảo quản tơm.
26
Bảng 2.3. Phương pháp sàng lọc hoạt tính chống oxy hóa
STT Mẫu Phương pháp thử Thơng số đánh giá
1 2 3 4 E-RH E-TH E-LH E-HH
Xác định tổng hàm lượng polyphenol mg GAE/g cao khô
5 6 7 8 E-RH E-TH E-LH E-HH Xác định hoạt tính ức chế gốc tự do (DPPH) Phần trăm bắt gốc tự do Giá trị IC50 (µg/mL) 9 10 11 12 E-RH E-TH E-LH E-HH
Xác định hoạt tính khử Fe3+ Độ hấp thu màu của mẫu EC50 (mg/mL)
Địa điểm thực hiện: Phịng thí nghiệm Cơng nghệ cao, trường Đại học Sư phạm Kỹ thuật Tp.HCM.
2.2.4. Sàng lọc hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase
Mục tiêu: xác định khả năng ức chế enzyme tyrosinase của 4 loại cao trích để lựa chọn loại cao trích có hoạt tính tốt nhất ứng dụng vào q trình bảo quản tơm.
Bảng 2.4. Phương pháp sàng lọc hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase
STT Mẫu Phương pháp thử Thông số đánh giá
1 2 3 4 E-RH E-TH E-LH E-HH
Xác định khả năng ức chế tyrosinase Phần trăm ức chế tyrosinase Giá trị IC50 (µg/mL)
Địa điểm thực hiện: Phịng thí nghiệm Cơng nghệ cao, trường Đại học Sư phạm Kỹ thuật Tp.HCM.
27
Mục tiêu: xác định thành phần hóa học của mẫu cao trích có hoạt tính sinh học cao nhất.
Bảng 2.5. Xác định thành phần hóa học
Mẫu cao trích Phương pháp thử Thông số đánh giá
E-LH Sắc ký lỏng hiệu năng cao kết hợp ghép khối phổ (HPLC-MS)
Các hợp chất có mặt trong cao trích theo m/z tương ứng
Địa điểm thực hiện: Phịng Thí nghiệm Phân tích trung tâm – Đại học Khoa học Tự nhiên Tp. Hồ Chí Minh.
2.2.6. Ứng dụng bảo quản tôm
Mục tiêu: lựa chọn mẫu cao trích có hoạt tính cao nhất và ứng dụng vào bảo quản tôm. So sánh chất lượng tôm với nước cất thông qua việc khảo sát các chỉ tiêu hóa học và vi sinh.
Bảng 2.6. Ứng dụng bảo quản tôm
Mẫu cao trích Phương pháp thử Thơng số đánh giá
E-LH
Xác định chỉ số melanosis % thay đổi tương đối
Xác định sự thay đổi pH pH
Xác định chỉ số oxy hóa axit thiobarbituric (TBARS)
mgMDA/kg tôm
Xác định tổng hàm lượng nito bazo bay hơi (TVBN)
mgN/100g
Xác định chỉ tiêu vi sinh
Định lượng tổng vi sinh vật hiếu khí Định lượng vi khuẩn khử sulfite trong điều kiện kị khí
Định lượng Pseudomonas aeruginosa
CFU/g
Địa điểm thực hiện: Phịng thí nghiệm Cơng nghệ cao, trường Đại học Sư phạm Kỹ thuật Tp.HCM. Phịng thí nghiệm Upscience Vietnam, tỉnh Bình Dương, Việt Nam.
28
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Phương pháp xác định tổng hàm lượng polyphenol
Nguyên tắc: Các mẫu cao được chiết bằng methanol 70% (MeOH) ở nhiệt độ 70oC. Các polyphenol trong cao chiết sẽ được xác định bằng phương pháp so màu thuốc thử Folin- Ciocalteu. Thuốc thử này chứa chất oxy hóa là axit phospho-vonframic. Các nhóm hydroxy phenol dễ bị oxy hóa trong q trình khử sinh ra màu xanh có độ hấp thu cực đại ở bước sóng 765 nm. Phản ứng này là do sự hình thành màu xanh của vonfarm và molypden. Thuốc thử Folin-Ciocalteu phản ứng với nhiều hợp chất polyphenol và các hợp chất đơn lẻ khác nhau, việc lựa chọn axit gallic làm chất chuẩn hiệu chuẩn cũng giúp ích cho việc thu được dữ liệu polyphenol tổng (TCVN 9745-1: 2013).
29
Hình 2.3. Quy trình xác định tổng polyphenol Thuyết minh quy trình Thuyết minh quy trình
Tổng hàm lượng polyphenol được xác định theo TCVN 9745-1: 2013 có thêm một số hiệu chỉnh. Hịa tan 0,2g cao trích vào 10ml MeOH 70% ở 70oC rồi đun nóng 10 phút, lắc đều 5 phút. Q trình này được tiến hành 2 lần. Dung dịch sau đó được li tâm 3500 vòng trong 10 phút hoặc sử dụng giấy lọc tinh để loại bỏ hết phần cặn cịn sót lại. Từ dịch chiết này, tiếp tục pha lỗng với hệ số F thích hợp.
Cao trích Đun nóng 70oC Hịa tan Lắc đều MeOH 70% (nếu có) Li tâm/lọc Lắc đều Ủ tối 30 phút Để yên 3 – 8 phút Đo UV-VIS 760 nm Na2CO3 10% (nếu có) Thuốc thử Folin 20% Hút dịch chiết
30
Dung dịch mẫu sau pha loãng được dùng để thực hiện đo UV- Vis. Hút 1,3 ml dịch mẫu cho vào ống thủy tinh rồi thêm 1 mL thuốc thử Folin 20% và lắc đều. Để yên dung dịch trong khoảng 3-8 phút rồi thêm 700 μL dung dịch Na2CO3 10%, ủ tối dung dịch trong 30 phút ở nhiệt độ phịng. Sau đó, rót dung dịch vào cuvet 1 cm và thực hiện đo mật độ quang với bước sóng 760 nm. Mỗi mẫu đo lặp lại 3 lần. Tổng hàm lượng polyphenol được tính tốn bằng cách quy về lượng tương đương với chất chuẩn axit galic, được biểu diễn theo số mg GAE/g cao.
Cơng thức tính hàm lượng polyphenol trong mẫu cao trích
(2.2)
Trong đó:
X : Hàm lượng tổng polyphenol trong mẫu quy về lượng tương đương với chất chuẩn axit gallic (mg GAE/g cao khô)
C : Nồng độ polyphenol tính từ đường chuẩn (mg/L) F : hệ số pha loãng (từ dung dịch đã chiết 10mL) m : khối lượng cân của mẫu cao trích (g)
%H : Độ ẩm trong cao trích
2.3.2. Phương pháp xác định khả năng bắt gốc tự do DPPH
Nguyên tắc: Phương pháp này xác định hoạt độ của chất chống oxy hóa trong thực
phẩm bằng phản ứng DPPH gốc bền. Các chất chống oxy hóa sẽ trung hịa gốc DPPH bằng cách cho hydrogen tạo thành DPPH – H khử và làm giảm độ hấp thu cực đại tại bước sóng 517 nm. Quá trình phản ứng làm màu của dung dịch nhạt dần, chuyển từ màu tím sang vàng nhạt. Giá trị mật độ quang OD càng thấp chứng tỏ khả năng bắt gốc tự do DPPH càng cao (Brand – Williams và cộng sự. 1995, TCVN11939:2017).
31
Hình 2.4. Quy trình xác định khả năng bắt gốc tự do DPPH Thuyết minh quy trình Thuyết minh quy trình
Hoạt tính chống oxy hóa của cao trích cây Huỳnh Anh được xác định theo phương pháp của (Tun, Lae, Win, & Ngwe, 2019) có thêm một số hiệu chỉnh. Pha loãng 3,94 mg DPPH trong 100 mL EtOH 96o tạo dung dịch DPPH. Cân 0,005 g cao trích và hịa tan vào 10 ml EtOH 96o trong ống nghiệm tạo dung dịch có nồng độ 500 μg/mL. Sử dụng EtOH 96o để pha lỗng dung dịch gốc tạo dãy dung dịch mới có nồng độ 10, 25, 50 và 100 μg/mL. Thêm 1500 μL DPPH và mẫu của các nồng độ khác nhau, ủ tối 30 phút ở nhiệt độ phịng. Các mẫu blank khơng chứa DPPH. Tiến hành đo mật độ quang của từng dung dịch ở bước sóng 517 nm. Mỗi nồng độ thực hiện 3 lần lặp. Phương pháp sử dụng gallic acid làm chất chuẩn.
Cơng thức tính phần trăm bắt gốc tự do DPPH (Mannan et al., 2017)
Cao trích Lắc đều Pha lỗng Ủ tối 30 phút Lắc đều Đo quang ở 517 nm EtOH 96o EtOH 96o DPPH
32
(2.3) Trong đó:
AC : Gía trị mật độ quang của dung dịch khơng có mẫu cao (control) AS : Gía trị mật độ quang của dung dịch có mẫu cao (sample)
2.3.3. Phương pháp xác định khả năng khử
Nguyên tắc: Mẫu thử sẽ khử ion Fe3+ trong phân tử kali ferricyanid (K3[Fe(CN)6]) thành ion Fe2+. Khi bổ sung FeCl3, Fe3+ sẽ phản ứng với ion ferrocyanid tạo thành phức hợp ferris ferrocyanid (Fe4[Fe(CN)6]3) có màu xanh dương. Phức hợp này được đo ở bước sóng 700nm và khi đo độ hấp thu ở bước sóng này cho thấy sự tăng khả năng khử của mẫu thử (Vijayalakshmi & Ruckmani, 2016)
33
Hình 2.5. Quy trình xác định khả năng khử Thuyết minh quy trình Thuyết minh quy trình
Phương pháp được tiến hành theo nghiên cứu của (Mannan et al., 2017) và có hiệu chỉnh. Cân 10 mg cao trích và hịa tan vào 10 ml đệm phosphate 0,2M (pH=6,6). Dung dịch sau đó được pha lỗng tạo thành các dung dịch có nồng độ 0,1; 0,5 và 1 mg/ml. Hút 1ml dung dịch rồi thêm 1 mL potassium ferricyanide (K3[Fe(CN)6]) 1% và ủ ở nhiệt độ 500C trong 20 phút. Sau đó, thêm vào mỗi ống 1 mL trichloroacetic acid (TCA) 10% và ly tâm 2000 rpm trong 10 phút. Hút 1ml dịch nổi bề mặt hòa tan với 1ml nước cất và 0,2ml ferric chloride (FeCl3) 0,1%. Đo mật độ của dung dịch ở bước sóng 700 nm. Đối với mẫu đối chứng thay FeCl3 0,1% bằng nước cất. Mỗi nồng độ thực hiện 3 lần lặp.
Cao trích Lắc đều Lắc đều Ủ Li tâm Đệm phosphate K3[Fe(CN)6] 1% Hút dịch trên bề mặt TCA 10% Lắc đều Đo mật độ quang Nước cất FeCl3 0,1%
34
2.3.4. Phương pháp xác định hoạt tính tyrosinase
Nguyên tắc: Phương pháp xác định hoạt tính polyphenol oxidase sử dụng L–DOPA
làm cơ chất (Nirmal N P, Benjakul S, 2009). Môi trường đệm pH=6,8 enzym tyrosinase sẽ chuyển hóa L-DOPA thành DOPAchrome màu đỏ cam có độ hấp thu cực đại tại bước sóng λmax= 475 nm (Các mẫu khảo sát hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase sẽ làm giảm hoạt tính xúc tác của enzyme dẫn đến cường độ màu sẽ giảm.
Hình 2.6 Quy trình xác định hoạt tính tyrosinase Thuyết minh quy trình Thuyết minh quy trình
Mẫu được hịa tan trong đệm phosphate pH= 6,8. Thêm 100 μL enzyme tyrosinase 300 U ml-1 và ủ 30 phút trong tủ lạnh. Sau đó, bổ sung 1000 L chất nền L-DOPA (1,5 mM) rồi lắc đều và đợi lên màu trong 7 phút. Mẫu được đo mật độ quang tại bước sóng
Cao trích Pha lỗng Phối trộn Lắc đều Ủ lạnh Lên màu Đệm phosphate Enzyme tyrosinase L - DOPA Đo quang ở 475 nm
35
= 475 nm. Mỗi mẫu thực hiện lặp 3 lần. Kojic acid (5-hydroxy-2-hydroxymethyl-4H-pyran- 4-one) được dùng làm chất đối chứng dương.
Phần trăm ức chế được biểu thị theo công thức:
I (%) = x100 (2.4) Trong đó:
A: hoạt tính PPO của mẫu đối chứng B: hoạt tính PPO của mẫu khảo nghiệm
2.3.5. Phân tích thành phần hóa học (HPLC-MS)
Mẫu cao tối ưu được thực hiện sắc kí lỏng hiệu năng cao kết hợp ghép khối phổ.
2.3.6. Ứng dụng bảo quản tơm
Hình 2.7. Quy trình xử lý tơm ngun liệu Thuyết mình quy trình Thuyết mình quy trình
Tơm sau khi được thu nhận phải cịn ngun vẹn, ở trạng thái tươi sống, khơng có màu sắc hoặc mùi lạ. Tôm được giữ trong thùng xốp có đá lạnh với tỉ lệ khối lượng tôm và nước là 1:2 và được vận chuyển đến phịng thí nghiệm trường Đại học Sư Phạm Kĩ Thuật. Tiến hành rửa tôm với nước lạnh để loại bỏ tạp chất. Mục đích là đảm bảo nguyên liệu sạch,
Tôm tươi Rửa sạch Lạnh đông Để ráo Ngâm Bảo quản Phụ gia
36
khơng có tạp chất gây ảnh hưởng tơm trong q trình bảo quản. Tơm được lạnh đơng ở 0oC trong thời gian 60 phút trước khi tiến hành ngâm dịch cao. Sau khi lạnh đông, tôm được ngâm trong dung dịch cao trích có nồng độ lần lượt là 0,1 – 0,5 – 1 % với tỉ lệ tôm và dịch cao là 1:2. Mục đích của q trình ngâm tôm là hạn chế sự tác động bất lợi của vi sinh vật và các phản ứng hóa học, sinh học trên tôm. Sau thời gian ngâm 15 phút, tôm được vớt ra để ráo. Mẫu được chứa trong các bao bì plastic và bảo quản 8 ngày trong thùng xốp chứa đá. Đá được thay 2 ngày 1 lần nhằm đảm bảo tỉ lệ tơm: đá là 1:2. Q trình rã đơng tơm được thực hiện vào các ngày nhất định. Mục đích là ghi nhận sự thay đổi trên tơm, so sánh kết quả với mẫu tôm được ngâm trong nước cất (Sae-Leaw & Benjakul, 2019).