10. Ethidium bromide, acridinedyes
2.2.3. Lên men sản xuất enzyme
Trong q trình sản xuất enzyme, có nhiều phương thức lên men được các nhà sản xuất chấp nhận, trong đó có hai phương pháp chính là lên men chìm
(Submerged fermentation - SmF) và lên men bềmặt rắn (Solid state fermentation - SSF). Trong những thập kỷgần đây, các nhà nghiên cứu và sản xuất có xu hướng sửdụng kỹthuật lên men bềmặt rắn (SSF) đểsản xuất ra nhiều enzyme từcác vi sinh vật (Singh & cs., 2011).
2.2.3.1. Lên men bề mặt rắn/Lên men xốp (Solid state fermentation - SSF)
Lên men bềmặt rắn được định nghĩa là quá trình lên men gồm cơ chất rắn
và được thực hiện trong điều kiện không hoặc gần như khơng có mặt của nước tự do; tuy nhiên cơ chất phải có đủ độ ẩm đểcung cấp cho sự sinh trưởng và quá trình
trao đổi chất của vi sinh vật (Singhania & cs., 2009). Tiềm năng của SSF nằm trong việc đưa vi sinh vật nuôi cấy trong mơi trường có nồng độ cơ chất cao nhất đểlên men, hệthống SSF giống với môi trường sống tựnhiên của các vi sinh vật do đó đây là lựa chọn thích hợp cho sự sinh trưởng và tạo ra các sản phẩm có giá trị
(Singhania & cs., 2009). Q trình lên men SSF có tiềm năng to lớn trong việc sản xuất enzyme. Ngồi các ứng dụng thơng thường trong các ngành công nghiệp thực phẩm và lên men, enzyme của vi sinh vật cịn có vai trị quan trọng trong chuyển hóa sinh học các dung mơi hữu cơ, chủ yếu cho các chất có hoạt tính sinh học (Pandey & cs., 1999).
a. Ưu nhược điểm của lên men bềmặt rắn
Lên men bềmặt rắn nhận được nhiều sựquan tâm của của các nhà nghiên cứu cho sản xuất nhiều loại enzyme cơng nghiệp do những ưu điểm của nó đem
lại như sau: Lên men bềmặt rắn dễthực hiện, quy trình cơng nghệ thường không phức tạp, yêu cầu đối với các thiết bị lên men đơn giản, không tốn kém, do đó giảm thiểu chi phí trong q trình sản xuất.Môi trường nuôi cấy trong lên men rắnđơn
giản. Một số cơ chất có thể được sử dụng trực tiếp như là môi trường rắn hoặc
được bổsung thêm một sốchất dinh dưỡng. Lên men bềmặt rắn cho năng suất cao
hơn trong một khoảng thời gian ngắn hơn, lượng enzyme được tạo thành từ lên men bề mặt thường cao hơn rất nhiều so với lên men chìm. Đây là đặc điểm ưu
việt rất quan trọng trong giải thích tại sao phương pháp ni cấy bềmặt hiện nay phát triển mạnh trởlại. Sản phẩm thu hồi sau lên men với lượng dung mơi ít, hạn chế nước thải ra môi trường. Mặt khác, sản phẩm sau khi thu nhận dễsấy khô và dễbảo quản và dễtinh sạch.Hàm lượng ẩm thấp, do đó hạn chếsựlây nhiễm của các vi sinh vật khác. Dễdàng xửlý khi bịtạp nhiễm trong quá trình lên men (Singhania & cs., 2009).
Lên men bềmặt rắn mặc dù có nhiều ưu điểm song vẫn cịn một số nhược
cản về hàm lượng ẩm của mơi trường. Khó khăn trong việc xác định các thơng số của mơi trường lên men như pH, oxy tựdo, CO2(Singhania & cs., 2009).
b.Vi sinh vật sửdụng cho sản xuất enzyme bằng lên men bềmặt rắn
Trong lên men SSF, hầu hết các nhóm vi sinh vật (nấm men, nấm sợi, vi khuẩn) đều có thể sinh trưởng và phát triển trên bề mặt mơi trường rắn đểsinh ra các nhóm enzyme khác nhau. Việc lựa chọn một chủng đặc thù tùy thuộc vào mục đích, yêu cầu và một sốyếu tố, đặc biệt là tính chất của cơ chất và điều kiện mơi trường. Tuy nhiên, nấm sợi là thích hợp cho lên men SSF vì cơ chất và các điều kiện trong SSF gần giống với điều kiện sống tự nhiên của nấm sợi (Tengerdy & Szakacs, 2003).
Các enzyme thủy phân như cellulase, xylanase, pectinase... hầu hết đều được tạo ra bởi các lồi nấm sợi, vì các enzyme đó được sử dụng trong tựnhiên cho sự sinh trưởng của chúng. Trichoderma sp. và Aspergillus niger đã được sử dụng rộng rãi nhất cho các enzym này. Các enzyme phân giải tinh bột cũng thường được tạo ra bởi nấm sợi và các chủng ưa thích thuộc về các lồi thuộc chi
Aspergillusvà Rhizopus. Mặc dù việc sản xuất thương mại của amylases được thực hiện bằng cách sửdụng cả các chủng nấm và vi khuẩn, α- amylase của vi khuẩn thường dùng để phân giải tinh bột do sự ổn định với nhiệt độ cao của nó. Để đạt được hiệu suất cao với chi phí sản xuất thấp, dường như các dịng biến đổi gen sẽ đóng vai trị chính trong việc sản xuất enzyme (Pandey & cs., 1999).
c. Cơ chất sửdụng trong lên men bềmặt rắn đểsản xuất enzyme
Trong môi trường lên men bềmặt rắn, các vi sinh vật sẽphát triển trên bề mặt môi trường, nhận chất dinh dưỡng từ hạt môi trường và sinh tổng hợp ra enzyme nội bào và ngoại bào. Các enzyme ngoại bào sẽthẩm thấu vào trong các hạt mơi trường, cịn các enzyme nội bào nằm trong sinh khối vi sinh vật.
Việc lựa chọn cơ chất cho sản xuất enzyme bằng lên men SSF phụthuộc vào nhiều yếu tố, chủyếu liên quan đến chi phí và sựtiện lợi của cơ chất, do đó có thểbao gồm việc lựa chọn một sốloại phếthải nơng nghiệp. Trong q trình SSF, cơ chất không chỉcung cấp chất dinh dưỡng cho sự sinh trưởng của vi sinh vật mà cịn cịn đóng vai trị như vịtrí neo giữcho các tế bào. Cơ chất mà cung cấp tất cả các chất dinh dưỡng cần thiết cho vi sinh vật phát triển được coi là cơ chất lý tưởng. Tuy nhiên, một sốcác chất dinh dưỡng có thểcó ởnồng độ dưới mức tối ưu, hoặc thậm chí khơng có trong các cơ chất. Trong những trường hợp như vậy, cần thiết
phải bổsung thêm các chất dinh dưỡng khác ởbên ngoài. Một sốloại cơ chất cũng cần phải được xử lý trước trước khi được sửdụng cho SSF (hóa học hoặc cơ học) như ligno-xenlulose, để cho vi sinh vật dễ sử dụng hơn cho sự sinh trưởng của chúng (Pandey & cs., 1999).
Trong sốcác yếu tố cần thiết cho sựphát triển của vi sinh vật và sản xuất enzyme việc sửdụng cơ chất đặc thù, kích thước hạt và độ ẩm/hoạt độ nước là yếu tốquan trọng nhất (Pandey & cs., 1999). Vi sinh vật không chỉphát triển trên bề mặt môi trường, nơi ngăn cách pha rắn (mơi trường) và pha khí (khơng khí) mà cịn phát triển trên bềmặt của các hạt môi trường nằm hẳn trong lịng mơi trường. Môi trường ni cấy cần vừa có độxốp cao và vừa phải có độ ẩm thích hợp. Các hạt cơ chất có kích thước càng nhỏ càng cung cấp diện tích bềmặt lớn cho sựtấn cơng của vi sinh vật, đó là một yếu tố mong muốn. Tuy nhiên, kích thước các hạt cơ chất quá nhỏ làm cho cơ chất bịbết lại có thểgây cản trởcho q trình hơ hấp của các vi sinh vật hiếu khí, làm cho chúng sinh trưởng kém. Trái lại, các hạt có kích thước lớn sẽtạo điều kiện cho hoạt động hô hấp tốt hơn (do tăng không gian giữa các hạt), nhưng cung cấp bềmặt giới hạn cho sựtấn công của vi sinh vật. Vì vậy kích thước của các hạt phải được xem xét, lựa chọn cho phù hợp với từng quy trình cụthể(Pandey & cs., 1999).
Lên men xốp khác với lên men lỏng, vì sự sinh trưởng của vi sinh vật và sản phẩm tạo ra ởtrên hoặc cạnh bềmặt của các hạt cơ chất rắn có độ ẩm thấp. Do đó, điều quan trọng là phải cung cấp cấp một hàm lượng nước tối ưu và kiểm soát hoạt độ nước của cơ chất cho quá trình lên men, vì sựcó mặt của nước ởnồng độ thấp hơn hoặc cao hơn sẽ ảnh hưởng xấu đến hoạt động của vi sinh vật. Hơn nữa, nước có tác động lớn đến các tính chất lý hố của chất rắn và điều này ảnh hưởng đến năng suất của quá trình lên men (Pandey & cs., 1999).
Phếthải nông nghiệp được coi là nguồn cơ chất tốt nhất cho quá trình SSF. Trong những năm gần đây, nhiều phụ phẩm công-nông nghiệp đã được sửdụng làm cơ chất cho SSF như: bã mía, cám mì, cám gạo, cám ngơ, cám đậu, rơm rạ, vỏ trấu, bã đậu nành, xơ dừa, bã sắn, bã thải dầu cọ, bột sắn, bột mì, bột ngơ, bột giấy, bột củcải đường, bột đậu phộng....Trong đó, bã sắn và bã mía có nhiều lợi thế hơn so với các cơ chất khác như rơm lúa, vì hàm lượng tro thấp, khả năng giữ nước cao. So với bã mía thì bã sắn có lợi thế hơn là nó khơng u cầu q trình tiền xử lý và có thểphân hủy bởi hầu hết các vi sinh vật cho các mục đích khác nhau. Bã sắn được sửdụng nhiều trong sản xuất axit citric, hương liệu, và các chất trao đổi
khác (Pandey & cs., 1999).
d. Các yếu tố ảnh hưởng đến sản xuất enzyme trong các hệthống lên men bềmặt rắn
Các yếu tốchính ảnh hưởng đến sựtổng hợp enzyme của vi sinh vật trong hệthống lên men xốp gồm: lựa chọn cơ chất và vi sinh vật phù hợp; tiền xử lý cơ chất; kích thước hạt (khoảng trống giữa các hạt và diện tích bềmặt) của cơ chất; hàm lượng nước và hoạt độ nước của cơ chất; độ ẩm tương đối; loại và lượng của vi sinh vật cấy vào; kiểm soát nhiệt độcủa vật chất lên men/loại bỏnhiệt của q trình trao đổi chất; duy trì tính đồng bộ trong môi trường của hệthống lên men xốp và mơi trường khơng khí xung quanh, như tốc độhấp thụoxy và giải phóng CO2 (Pandey & cs., 1999).
2.2.3.2. Lên men chìm/lên men lỏng (Submerged Fermentation- SmF/ Liquid Fermentation - LF)
Lên men chìm là q trình ni cấy vi sinh vậttrong mơi trường lỏng, tất cảcác chất dinh dưỡng có trong mơi trường cho sựphát triển của vi sinh vật trong quá trình lên men phải ngập nước. Các yếu tố cần kiểm sốt trong lên men chìm là: nhiệt độ, pH, tốc độkhuấy, nồng độoxy...Các hợp chất hoạt tính sinh học được tiết ra trong môi trường lên men. Cơ chất trong quá trình lên men được sửdụng khá nhanh do đó cần phải được thay thế hoặc bổ sung chất dinh dưỡng liên tục (Subramaniyam & cs., 2012). Lên men chìm là phương pháp được sử dụng phổ biến trong quy trình lên men cơng nghiệp vì có thể kiểm sốt được tồn bộ các thơng sốcủa q trình lên men, do đó có thể lên men lớn với thể tích thay đổi từ hàng nghìn đến hàng trăm nghìn lít.
a. Ưu nhược điểm của lên men chìm
So với phương pháp lên men bềmặt rắn, thì lên men chìm có nhiều ưu điểm đó là: Tốn ít diện tích, vi sinh vật chỉcần ni cấy trong một thiết bịvới thểtích lớn, diện tích mặt thống nhỏ, do đó việc kiểm sốt độvơ trùng tốt, dễdàng kiểm sốt được tồn bộ quy trình, dễ cơ giới hóa và tự động hóa trong q trình theo dõi, ít cần sửdụng nhân lực và đảm bảo độ đồng nhất của sản phẩm (do chúng cùng được thu từmột thiết bị).
Tuy nhiên phương pháp lên men chìm có một số nhược điểm như sau: Địi hỏi đầu tư nhiều kinh phí cho trang thiết bị. Trong lên men chìm cần phải khuấy và sục khí liên tục vì vi sinh vật chỉsửdụng được ơxy hồ tan trong mơi trường. Khí được nén qua một hệ thống lọc sạch tạp trùng, hệthống này tương đối phức tạp và dễgây nhiễm cho môi trường nuôi cấy. Nếu một mẻlên men vì một lý do
nào đó bịxửlý thì khơng thểxửlý cục bộ được, đa phần phải hủy bỏcảquá trình lên men, gây tốn kém lớn. Phế liệu của quá trình lên men thải ra phải kèm theo cơng nghệxửlý chống ô nhiễm môi trường.
b. Vi sinh vật sửdụng trong lên men chìm
Phương pháp này dùng cho cảvi sinh vật kị khí và hiếu khí. Đối với ni vi sinh vật kịkhí trong q trình ni khơng cần sục khí chỉ thỉnh thoảng khuấy trộn cịn với vi sinh vật hiếu khí thì phải sục khí liên tục. Đây là phương pháp hiện đại đã được dùng trong khoảng nửa cuối thế kỉ XX và cho kết quả rất to lớn đối với công nghệvi sinh.
c. Cơ chất sửdụng trong lên men chìm
Một số cơ chất phổbiến được sửdụng trong quá trình lên men chìm là các loại đường hịa tan, rỉmật, các loại mơi trường lỏng, nước ép trái cây, rau quả, và nước thải
d. Các yếu tố ảnh hưởng đên lên men chìm
Ni cấy chìm hay ni cấy bề sâu dùng môi trường dịch thể. Chủng vi sinh vật cấy vào môi trường được phân tán khắp mọi điểm và chung quanh bề mặt tế bào được tiếp xúc với dịch dinh dưỡng. Đặc điểm này đòi hỏi trong suốt q trình ni cấy phải khuấy và cung cấp ơxy bằng cách sục khí liên tục.
Ngày nay phương pháp ni cấy chìm được dùng phổbiến trong cơng nghệ vi sinh đểsản xuất men bánh mì, protein đơn bào, các chế phẩm vi sinh làm phân bón, thuốc trừ sâu, các enzyme, các acid amin, vitamin, các chất kháng sinh, các chất kích thích sinh học v.v...
Lên men xốp được đánh giá là con đường tốt nhất đểsản xuất enzyme và các sản phẩm bền nhiệt khác. Lên men xốp ngày càng được sửdụng rộng rãi trong sản xuất cũng như trong nghiên cứu vì những ứng dụng mang tính thực tiễn và kinh tế của nó. Lên men xốp được dùng trong công nghiệp chế biến và sản xuất thực phẩm chủ yếu là lĩnh vực sản xuất các loại hương liệu, sản xuất enzyme (a- amylase, fructosyl transferase, lipase, pectinase, xylanase), các acid hữu cơ (acid lactic, acid citric) và các loại kẹo cao su. Trước đây, trong sản xuất enzyme người ta thường sửdụng kỹthuật lên men dịch thể. Tuy nhiên, khi tiến hành so sánh hiệu quảcủa các loại hình lên men, người ta thấy hàm lượng enzyme vi sinh vật có thể sinh ra trong lên men xốp cao hơn nhiều lần so với trong lên men dịch thể khi sử dụng cùng một chủng vi sinh vật trong cùng điều kiện lên men (Zambare, 2010).