A. Cành bào tử nấm A13: 1: Cuống
4.1.3. Hoạt tính enzyme của các các chủng đột biến
Các tếbào sống sót sau khi gây đột biến ởcác khoảng thời gian khác nhau (liều gây đột biến khác nhau) được nhặt ngẫu nhiên, cấy chuyển sang các đĩa môi trường PDA, nuôi cấy ở28oC trong 5 ngày. Tiến hành nghiên cứu khả năng thủy phân trực tiếp cơ chất tinh bột, xơ (CMC) trên đĩa thạch (PDA), chọn lọc được 20 chủng tiềm năng có khả năng sinh enzyme cao, lên men trên cơ chất xốp để xác định hoạt tính α-amylase, glucoamylase và cellulase của các chủng này.
Bảng 4.1. Hoạt tính enzyme của các chủngđột biến (n=3) Thời gian gây đột biến (phút) Chủngđột biến Hoạt tính enzyme (U/g) (LSM)* Glucoamylase α- amylase Cellulase
0 A45.1 (Chủng dại) 12,47fhi 19,60cdef 6,40bcdef
30
GA11 10,88hi 15,01defg 4,26ef GA12 14,41efh 20,90cde 6,31bcdef GA13 18,41cdef 27,57bc 4,66def
GA14 21,41abcd 32,57ab 11,81a
GA15 27,41a 38,68a 12,16a
60
GA21 7,98hi 10,18ghi 6,08cdef
GA22 21,53abcd 32,76ab 8,81abcdf
GA23 15,69def 23,04cd 12,68a
GA24 21,31abcd 32,40ab 10,91ab
GA25 12,10fhi 6,16hi 8,38abcde
90
GA31 15,82edf 8,02ghi 7,99abcdef
GA32 20,38bcde 10,30ghi 9,42abcd
GA33 22,43abcd 11,33fghi 6,55bcdef
GA34 26,60ab 13,41efgh 5,77cdef
GA35 26,16ab 13,19efgh 9,77abc
120
GA41 22,82abc 11,52fghi 6,71cbdef
GA42 21,66abcd 10,94ghi 8,04bcdef
GA43 6,21i 3,21i 6,99bcdef
GA44 8,19hi 4,17i 3,41ef
GA45 16,42cdef 8,28ghi 4,51ef
SEM 1,27 1,56 0,89
P <0,0001 <0,0001 <0,0001*Trong cùng một cột, những giá trị LSM (trung bình bình phương nhỏnhất) có các chữ cái khác nhau thì sai khác nhau có ý nghĩa thống kê (P<0,05). *Trong cùng một cột, những giá trị LSM (trung bình bình phương nhỏnhất) có các chữ cái khác nhau thì sai khác nhau có ý nghĩa thống kê (P<0,05).
Kết quả cho thấy, hoạt tính enzyme của các chủng đột biến có sựsai khác đáng kể (p<0,001). Hoạt tính enzyme glucoamylase cao thuộc về chủng GA15, GA14 (liều gây đột biến 30 phút), GA22, GA24 (liều gây đột biến 60 phút), GA33, GA34, GA35 (liều gây đột biến 90 phút), chủng GA42 (liều gây đột biến 120 phút) với hoạt tính glucoamylase trong khoảng 21,41 - 27,41 (U/g). Hoạt tính α-amylase cao ởcác liều gây đột biến 30 phút với chủng GA15, GA14 và ở60 phút với chủng GA22 và GA24, hoạt tính đạt được là 32,4 - 38,68 (U/g). Hoạt tính cellulase cao ở các liều gây đột biến 30, 60, 90 phút thuộc vềcác chủng GA15, GA14, GA23, GA24, GA25, GA31, GA32 và GA35, hoạt tính đạt được là 9,42 - 12,68 (U/g). Trong số các chủng đột biến kểtrên, chủng GA15 là chủng có hoạt tính của cả3 enzyme cao nhất. So với chủng dại, hoạt tính của α-amylase cao gấp 1,97 lần, glucoamylase cao gấp 2,2 lần, cellulase cao gấp 1,9 lần (Bảng 4.1).
Vi sinh vật có thể dễ dàng thao tác bằng cách sửdụng kỹ thuật di truyền hoặc các phương pháp khác để cải tiến chủng, tạo ra các đột biến và những thay đổi khác, nhờ đó việc sản xuất các enzyme có thể được tối ưu hóa. Trong hầu hết các trường hợp, tia UV gây ra những đột biến có hại nhưng đơi khi nó lại dẫn tới sựthích nghi của vi sinh vật với mơi trường và làm cải thiện hiệu suất trao đổi sinh học (Irfan & cs., 2011). Việc chiếu tia UV được tìm thấy là cách tốt nhất để cải thiện các chủng như Aspergillus niger để sản xuất tối đa nhiều loại enzyme (Olukunle & Ajayi, 2018). Olukunle & Ajayi (2018) tiến hành cải tiến chủng A.
flavus và A.nigerbằng gây đột biến với tia UV ở bước sóng 240nm trong 10, 20 và 30 phút, kết quả cho thấy hoạt độcủa amylase được tạo ra bởi các chủng nấm dao động từ 2,85 U/ml/phút đến 3,263 U/ml/phút. Trong đó, các chủng đột biến của A. niger ởliều tiếp xúc tia UV trong 10 phút có khả năng sản xuất amylase cao nhất. Raju & cs. (2012) đã nghiên cứu sự cải tiến của A. niger cho sản xuất glucoamylase bằng tác nhân vật lý (UV) và hóa học (Ethyl methyl sulphonate và ethidium bromide) và báo cáo rằng các chủng đột biến của A. nigercó khả năng sản xuất glucoamylase cao hơn so với chủng dại. Vu & cs. (2010) đã nghiên cứu việc sản xuất cao sản enzyme phân hủy tinh bột sống (RSDE) bằng việc gây đột biến lặp lại chủng nấm sợi Aspergillus nigervà nhận thấy rằng sựsản sinh RSDE được cải thiện cao hơn 2 lần so với chủng dại. Irfan & cs. (2011)đã tiến hành cải thiện sựsản xuất enzyme của chủng A.niger bằng gây đột biến với tia UV. Kết quảcho thấy, tia UV đã gây ra các đột biến và tăng cường hoạt tính của CMCase gấp 2 lần, của Fpase lên đến 3 lần so với chủng dại. Đối với enzyme avicelase, xylanase và sản xuất sinh khối nấm thì bức xạ tia UV chỉ ảnh hưởng nhẹso với dòng dại. Theo Agrawal &
cs. (1999) tia UV là một chất gây đột biến mạnh. Tia UV được tìm thấy là tốt nhất trong việc cải thiện các chủng như A.niger cho sựsản xuất tối đa các loại enzyme khác nhau. Chủng A. niger đột biến bởi tia UV có khả năng sản xuất lipase bằng 156% so với chủng dại. Chủng A.niger UAM-được xửlý bằng UV tăng sản xuất memicellolytic và cellulolytic (Nicolás-Santiago & cs., 2006) cho biết các chủng đột biến từ A. nigerUAM -GS1 được tạo ra bằng chiếu tia UV đã tăng đáng kểmức sản xuất các enzyme mannanase, xylanase và cellulase của chúng so với chủng dại ban đầu, cải thiện đáng kểcác ứng dụng công nghiệp tiềm năng của chúng.
Một số kết quả nghiên cứu đã chỉ ra rằng, các chủng đột biến do chiếu tia UV khơng có sự thay đổi nào trong hệ gen của chúng, khả năng tăng hoạt tính enzyme của những chủng này là do những thay đổi có thể xảy ra trong vùng promoter của các gen mã hóa cho các enzyme này. Tia phóng xạcó thểphá hủy sự điều hòa phiên mã của mARN tương ứng của enzyme, dẫn tới sản xuất enzyme (Nicolás-Santiago & cs., 2006; Li & cs., 2010; Singh & cs., 2013).
NTGcũng được coi là một chất gây đột biến hóa học hiệu quả, đây là chất alkyl hóa mạnh, làm đứt mạch ADN (Huang & cs., 2019). Vu & cs. (2011) cải tiến chủng nấm sợi Aspergillus nigerSU14 bằng tia Co60, UV và NTGđã lựa chọn được một chủng đột biến có khả năng sản sinh cellulase tăng gấp 2,2 lần so với chủng dại. Vu & cs. (2010) cho biết, sựkết hợp các nhân tố đột biến như tia γ(Co60), UV và NTG đã cho hiệu quả cao hơn trong việc gây đột biến các chủng nấm sợi để làm tăng khả năng sản xuất RSDE và lên men xốp ở điều kiện tối ưu đã làm tăng hiệu quảsản xuất RSDE cao gấp 19,23 lần so với kiểu dại ở cùng điều kiện.
Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng, việc kết hợp các tác nhân gây đột biến hóa học và vật lý trong cải tiến chủng đã làm tăng hoạt tính của một số enzyme của nhiều chủng vi sinh vật. Zhao & cs. (2014) nghiên cứu sựkết hợp của tia UV và tia Gamma Co60 trong gây đột biến A.niger để tăng cường hoạt tính của glucoamylase. Abdullah & cs. (2013) tiến hành gây đột biến chủng Aspergillus oryrae để tăng cường sản sinh α-amylase bằng tia UV và EMS, kết quảcho thấy hoạt tính của α-amylase của chủng đột biến tăng 2,1 lần so với chủng dại. Karanam & cs. (2008) cho biết, khi kết hợp tia UV, HNO2 và NTG đã làm tăng hoạt tính lipase của Aspergillus japonicus MTCC 1975 lên 276% so với chủng bốmẹ. Nadir & cs. (2013)cũng báo cáo rằng sựkết hợp của các nhân tố gây đột biến đểcải tiến chủng Leuconostoc mesenteries đã làm tăng hoạt tínhα-amylase gấp 7 lần và của glucoamylase gấp 3 lần so với chủng bốmẹ.