CHƯƠNG 2 : ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨ U
2.2 Vật liệu nghiên cứu
2.2.1 Bệnh phẩm:
- Các mẫu máu của bệnh nhân điều trị tại các khoa của Bệnh viện Bạch Mai được lấy làm xét nghiệm nuôi cấy.
- Số lượng máu lấy cho một mẫu nuôi cấy: + Người lớn: 3 - 5 ml
+ Trẻ em: 1 - 3 ml
- Phương pháp lấy mẫu máu: Lấy máu tĩnh mạch; có thể lấy máu theo các phương pháp khác nhau dưới đây tùy theo chỉ định lấy máu của bác sỹ:
+ Lấy máu 1 lần
+ Lấy máu 2 lần cách giờ + Lấy máu 3 lần cách giờ
+ Lấy máu 2 lần 2 vị trí khác nhau cùng giờ
Đối với lấy máu cách giờ, mỗi lần lấy máu có thể cách nhau 1 giờ hoặc có thể từ 2 - 4 giờ trong các trường hợp bệnh tim mạch.
2.2.2 Môi trường cấy máu:
- Chai cấy máu (dùng cho người lớn) Plus Aerobic/ F 30 ml (nắp màu ghi). - Chai cấy máu (dùng cho trẻ em) Peds Plus/ F 40ml (nắp màu hồng). Trong các môi trường cấy máu này có các thành phần dinh dưỡng và đặc biệt có resin có tác dụng bất hoạt KS và men penicillinase phá huỷ KS nhóm beta - lactam trong máu bệnh nhân.
Mơi trường này cũng có thể phát hiện được căn nguyên gây NTH là nấm. Các môi trường trên là sản phẩm của hãng Becton Dickinson (BD) (Mỹ).
Hình 2.1: Chai cấy máu người lớn (bên trái) và chai cấy máu trẻ em (bên phải)
2.2.3 Môi trường nuôi cấy phân lập, xác định VK:
2.2.3.1 Môi trường nuôi cấy VK:
- Thạch máu - Thạch chocolate - Thạch chapman
- Thạch B.E.A (gelose bile esculine azide) - Thạch thường
- Thạch mềm - Uri select 4
- Môi trường sabauraud ống - Môi trường candi select
- Canh thang thường - Canh thang NaCl 6,5%
Các môi trường nuôi cấy trên là sản phẩm của hãng Bio - Rad (Mỹ) và hãng Bio - Merieux (Pháp).
2.2.3.2 Môi trường định danh VK:
- Bộ sinh vật hóa học API E để xác định các lồi VK Gram - âm thuộc họ VK đường ruột (Enterobacteriaceae).
- Bộ sinh vật hóa học API NE để xác định các lồi VK Gram - âm khác, khơng thuộc họ VK đường ruột (non - Enterobacteriaceae).
- Bộ sinh vật hóa học API Staph để xác định được các loài cầu khuẩn Gram - dương.
- Bộ sinh vật hóa học API Strep để xác định được các lồi liên cầu. - Bộ sinh vật hóa học API Coryne để xác định được các loài trực khuẩn Gram - dương.
- Bộ sinh vật hóa học API C để xác định được các loài nấm Candida. Các bộ thử tính chất sinh vật hóa học là sản phẩm của hãng Bio - Merieux (Pháp).
2.2.4 Môi trường xác định độ nhạy cảm của vi khuẩn với kháng sinh:
Môi trường Mueller - Hinton của hãng Bio - Rad (Mỹ).
2.2.5 Các vật liệu, hóa chất khác:
- Nước muối sinh lý 0,85% - Thuốc thử oxydase
- Dung dịch H2O2 3% (xác định men catalase) - Các khoanh giấy xác định:
+ Optochin: Xác định phế cầu
+ Khoanh giấy bacitracin: Xác định liên cầu tan máu beta nhóm A - Bộ kháng huyết thanh liên cầu các nhóm A, B, C, D, F, G
- Bộ thuốc nhuộm Gram (dung dịch tím gentian, dung dịch lugol, cồn 90o, dung dịch đỏ fuchsin)
- Các loại khoanh giấy KS phục vụ kỹ thuật KS đồ - Các chủng quốc tế kiểm tra chất lượng KS đồ:
Escherichia coli ATCC 25922
Staphylococcus aureus ATCC 25923 Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853
2.2.6 Các dụng cụ khác:
- Ống nghiệm vô trùng - Tăm bông vô trùng - Pipet vô trùng
- Các máy móc, thiết bị:
+ Kính hiển vi với vật kính dầu + Lam kính
+ Que cấy
+ Máy cấy máu tự động Bactec 9240 của hãng BD (Mỹ) + Tủ ấm nuôi cấy VK (tủ ấm 37oC, tủ ấm CO2)
+ Máy lắc voltex
+ Trước đo vịng ức chế của KS với VK
+ Máy tính cài phần mềm đọc kết quả xác định tính chất sinh vật hóa học cho bộ API 20 các loại
Hình 2.2: Hệ thống máy cấy máu tự động Bactec 9240 (hãng BD - Mỹ) 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3 Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Thiết kế nghiên cứu:
Nghiên cứu mô tả cắt ngang.
2.3.2 Phương pháp chọn mẫu:
Tiêu chuẩn lấy mẫu:
- Các bệnh nhân nằm điều trị tại các khoa của bệnh viện Bạch Mai có nghi ngờ NTH, được bác sỹ lâm sàng chỉ định cấy máu.
- Các mẫu bệnh phẩm được lấy đủ số lượng máu quy định và có đầy đủ thông tin của bệnh nhân trên giấy xét nghiệm và trên chai máu.
- Các chai cấy máu sau khi lấy được gửi ngay đến phòng xét nghiệm khoa Vi sinh bệnh viện Bạch Mai trong vòng 2 giờ và các mẫu bệnh phẩm này không được giữ trong tủ lạnh.
- Các chủng VK nuôi cấy được từ máu tiếp tục được định danh theo thường quy của WHO.
- Các chủng VK đã định danh được thử nghiệm KS đồ bằng phương pháp Kirby - Bauer (kỹ thuật khoanh giấy KS khuếch tán).
- Các chủng VK được xác định sinh ESBL bằng phương pháp đặt khoanh giấy KS phối hợp với chất ức chế beta - lactamase.
2.3.3 Biến số và chỉ số nghiên cứu:
- Tỷ lệ cấy máu dương tính. - Tỷ lệ cấy máu nhiễm bẩn.
- Tỷ lệ cấy máu dương tính theo các phương pháp lấy máu. - Tỷ lệ các loại VK gây NTH.
- Tỷ lệ các loại nấm gây NTH.
- Đánh giá mức độ kháng KS của các chủng VK phân lập được.
2.3.4 Phương pháp nghiên cứu:
2.3.4.1 Ủ ấm và theo dõi chai cấy máu:
- Ủ ấm:
Chai cấy máu sau khi chuyển đến phòng xét nghiệm được ủ ấm ngay lập tức bằng hệ thống máy cấy máu tự động Bactec 9240 (chứa tối đa 240 chai): Quét mã số của chai cấy máu và đưa chai máu vào vị trí đã quy định.
- Theo dõi chai cấy máu:
+ Chai cấy máu được theo dõi hàng ngày nhờ hệ thống máy cấy máu tự động Bactec.
+ Máy cấy máu tự động ủ và lắc liên tục. Đèn huỳnh quang trong máy quét 10 phút/ lần vào lớp màng ở đáy chai để phát hiện nồng độ CO2. Nếu có sự phát triển của VK, CO2 sẽ được giải phóng ra mơi trường, máy Bactec phát hiện được sẽ báo kết quả dương tính. Máy Bactec có thể phát hiện sự có mặt của VK sớm nhất sau 2 giờ.
2.3.4.2 Phân lập VK:
- Dùng kim tiêm vô trùng hút một giọt cấy vào môi trường thạch máu. Ria đều. Để tủ ấm 37oC có 5 - 10% khí trường CO2 trong 24 giờ.
- Nhỏ một giọt máu lên lam kính nhuộm Gram quan sát hình thể VK. - Sau 24 giờ:
+ Có VK mọc ở thạch máu: Định danh VK
+ Khơng có VK mọc ở thạch máu: Lấy máu từ chai cấy lại vào môi trường chocolate và 2 ống sabauraud.
* Ủ ấm môi trường chocolate và một ống sabauraud ở 37oC có 5 - 10% CO2 trong 24 giờ.
* Để ống sabauraud còn lại theo dõi ở nhiệt độ phòng. - Sau 48 giờ:
+ Khơng có VK, nấm mọc: Tiếp tục nuôi cấy thêm 24 giờ nữa. + Có VK hoặc nấm mọc: Định danh VK, nấm.
- Sau 72 giờ:
+ Khơng có VK, nấm mọc: Trả lời kết quả âm tính. + Có VK, nấm mọc: Định danh VK, nấm.
2.3.4.3 Xác định tên vi khuẩn gây bệnh theo các tiêu chuẩn chẩn đoán [46]:
- Họ VK đường ruột Enterobacteriaceae: + Nhuộm Gram: Trực khuẩn Gram - âm + Ưa khí hoặc kỵ khí tùy tiện
+ Khuẩn lạc dạng S + Oxydase (-)
+ Có thể di động hoặc khơng di động + Không sinh nha bào
+ Xác định tính chất sinh vật hóa học bằng API E. Để tủ ấm 37oC/ 24 giờ. Đọc kết quả bằng máy tính cài phần mềm đọc giá đường.
Hình 2.3: Kết quả định danh API E số 4067m: E. coli (5144552)
- P. aeruginosa:
+ Nhuộm Gram: Trực khuẩn Gram - âm
+ Khuẩn lạc trên thạch máu dạng S, càng để lâu, khuẩn lạc càng trở nên dẹt, khơ và có xu thế lan ra.
+ Khuẩn lạc có sắc tố chủ yếu xanh; có mùi thơm do sinh ra chất kimetin.
+ Di động hiếu khí bề mặt. + Oxydase (+)
+ Xác định tính chất sinh vật hóa học bằng API NE. Để tủ ấm 30oC/ 24 - 48 giờ. Đọc kết quả bằng máy tính cài phần mềm đọc giá đường.
- Acinetobacter:
+ Nhuộm Gram: Cầu trực khuẩn Gram - âm
+ Khuẩn lạc nhẵn, đôi khi hơi nhầy, màu hơi xám trắng. + Không di động
+ Oxydase (-)
+ Xác định tính chất sinh vật hóa học bằng giá đường API 20NE. Để tủ ấm 30oC/ 24 - 48 giờ. Đọc kết quả bằng máy tính cài phần mềm đọc giá đường.
Hình 2.4: Kết quả định danh API NE số 4170m:
Pseudomonas stutzeri (0040655)
- S. aureus:
+ Nhuộm Gram: Cầu khuẩn Gram - dương đứng thành đám như chùm nho. + Mọc trên các môi trường nuôi cấy thông thường, khuẩn lạc dạng S. + Trên thạch máu gây tan máu hoàn toàn beta.
+ Catalase (+)
+ Lên men đường mannit. + Coagulase (+)
- Staphylococci coagulase (-):
+ Nhuộm Gram: Cầu khuẩn Gram - dương đứng thành đám như chùm nho. + Catalase (+)
+ Không lên men đường mannit + Coagulase (-)
+ Xác định tính chất sinh vật hóa học bằng API Staph. Để tủ ấm 37oC/ 24 giờ. Đọc kết quả bằng máy tính cài phần mềm đọc giá đường.
Hình 2.5: Kết quả định danh API Staph số 4600m:
Staphylococcus haemolyticus (2636111) - Streptococci:
+ Streptococcus nhóm viridans:
* Nhuộm Gram: Cầu khuẩn Gram - dương xếp đôi hoặc chuỗi.
* VK không mọc hoặc mọc kém trên các môi trường nuôi cấy thông thường. Trên thạch máu, khuẩn lạc nhỏ như đầu đinh ghim, trong, bóng. Nhiệt độ thích hợp là 37oC có 5% - 10% khí trường CO2.
* Tan máu khơng hồn tồn (anpha). * Optochin (-)
* Xác định tính chất sinh vật hóa học bằng API Strep. Để tủ ấm 37oC/ 24 giờ. Đọc kết quả bằng máy tính cài phần mềm đọc giá đường.
Hình 2.6: Kết quả định danh API Strep số 4605m :
Streptococcus nhóm viridans (4000441)
+ Streptococcus tan máu beta:
* Nhuộm Gram: Cầu khuẩn Gram - dương thường xếp thành chuỗi. * Trên thạch máu gây tan máu hoàn toàn beta.
* Catalase (-)
* Xác định tính chất sinh vật hóa học bằng API Strep. Để tủ ấm 37oC/ 24 giờ. Đọc kết quả bằng máy tính cài phần mềm đọc giá đường.
* Xác định kháng nguyên bằng thử nghiệm ngưng kết với kháng huyết thanh liên cầu để xác định các nhóm A, B, C, D, F, G.
Tính chất vi sinh vật hóa học của liên cầu tan máu beta (nhóm A, B, C và G theo phân loại Lancefield) [31]:
Lồi Nhóm Baci tr acin Pyrro lidony- la ryl amidas e CA MP Ar gi ni n VP β - g ala ct os i- dase H ipp ur at e G luc og en Ribose Sorb it ol Treh al ose S. pyogenes A + + - + - - - V - - + S. agalactiae B - - + + - - + - + - + S. dysgalactiae subsp equisimilis C - V - + - - - V + - +
S. equi subsp equi C - - - + - V - + - - V
S. equi subsp
zooepidemicus C - - - + - - - + + + -
S. canis G - - - + - + - - + - -
V: Có thể (+), có thể (-); CAMP (Christie, Atkins, Munch - Petersen): thử nghiệm phân biệt liên cầu nhóm B với các nhóm khác. VP: Voges - Proskauer.
- Enterococci (liên cầu nhóm D):
+ Nhuộm Gram: Cầu khuẩn Gram - dương, xếp thành đôi hoặc thành chuỗi ngắn.
+ Enterococci mọc tốt trên các môi trường: Thạch máu, thạch
chocolate, mọc được trong môi trường canh thang có 6,5% muối.
+ Một vài chủng của Enterococcus faecalis có thể gây tan máu hoàn toàn (beta).
+ Catalase (-).
+ Lên men đường esculin. - S. pneumoniae:
+ Nhuộm Gram: Cầu khuẩn Gram - dương hình ngọn nến, thường xếp thành đôi.
+ VK mọc dễ dàng trên mơi trường có nhiều chất dinh dưỡng. Trên thạch máu, khuẩn lạc trịn, lõm có núm, hơi xám, xung quanh có vịng tan máu khơng hồn tồn (anpha). Nhiệt độ thích hợp 37oC với khí trường có 5% - 10% CO2.
+ Catalase (-).
+ Optochin (+) (đường kính vịng vơ khuẩn > 14mm). + Bị ly giải trong muối mật (thử nghiệm Neufeld (+)).
2.3.4.4 Nhận định kết quả:
- Kết quả cấy máu dương tính:
+ Cấy máu 1 lần: Kết quả dương tính là VK gây bệnh thường gặp. + Cấy máu từ 2 lần trở lên: Kết quả dương tính là tất cả các loại vi sinh vật. - Kết quả cấy máu nhiễm bẩn (dương tính giả):
Trường hợp cấy máu 1 lần mà phân lập được các VK trên da, trong khơng khí:
+ Trực khuẩn Gram - dương (có nha bào và khơng có nha bào) + Staphylococci coagulase (-)
- Kết quả cấy máu âm tính:
Kết quả cấy máu âm tính gồm 2 trường hợp:
+ Dương tính giả: Máy Bactec báo dương tính giả do máu bị vỡ hồng cầu. Trong trường hợp này khơng có VK mọc.
+ Âm tính:
* Sau 4 ngày nếu không thấy dấu hiệu nghi ngờ có VK mọc thì có thể trả lời là “kết quả sơ bộ âm tính sau 4 ngày ni cấy”.
* Sau 5 ngày máy Bactec báo kết quả âm tính: Trả lời kết quả cấy máu là “âm tính sau 5 ngày ni cấy”.
- Tuy nhiên, những trường hợp trên lâm sàng nghi ngờ NTH do nấm thời gian theo dõi phải lâu hơn (10 - 15 ngày).
2.3.4.5 Xác định độ nhạy cảm với KS của VK bằng kỹ thuật khoanh giấy KS khuếch tán trong thạch theo CLSI [34], [43]:
- Nguyên lý:
KS được thấm vào những khoanh giấy với nồng độ nhất định, có đường kính thường là 6mm và được đặt tại một điểm trên mặt đĩa thạch dàn đều VK. KS từ khoanh giấy khuyếch tán ra môi trường xung quanh. Độ khuếch tán phụ thuộc vào tính chất của từng loại KS và độ dày của mơi trường. Vì vậy, càng xa nơi đặt khoanh giấy, nồng độ KS càng thấp và ngược lại, càng gần nơi đặt khoanh giấy, nồng độ KS càng cao.
Nơi có KS, VK khơng phát triển được gọi là vùng ức chế (inhibition zone). Đường kính vùng ức chế của từng loại KS tùy thuộc vào quy định của hãng. Khi đo vùng ức chế và so sánh với giới hạn chuẩn sẽ xác định VK nhạy cảm hay đề kháng với KS.
- Mục đích:
Xác định VK nhạy cảm hoặc đề kháng với loại KS nào (định tính). - Cách tiến hành:
+ Chủng VK gây bệnh đã thuần nhất (đã định danh) được cấy vào môi trường nuôi cấy khác nhau tùy thuộc từng loại VK (có thể thạch thường hoặc thạch máu hoặc thạch chocolate) trong 18 - 24 giờ (để lấy chủng VK còn non - chủng đang ở giai đoạn phát triển mạnh nhất).
+ Pha loãng hỗn dịch VK để đạt được huyền dịch VK có độ đục tương đương với độ đục chuẩn 0,5 Mc Farland (tương đương 108 VK/ml).
+ Dùng tăm bông vô trùng thấm ướt huyền dịch vừa pha (độ ẩm vừa phải), ria đều lên mặt đĩa thạch Mueller - Hinton (là môi trường chuẩn để tiến hành kỹ thuật kháng sinh đồ; độ dày thạch là 4 ± 0,5 mm).
+ Đặt các khoanh giấy KS lên mặt thạch đã ria VK, mỗi khoanh giấy cách thành đĩa từ 1,0 - 1,5 mm và cách nhau từ 2,0 - 2,5 mm.
+ Để đĩa thạch ở nhiệt độ phòng 20 phút.
+ Ủ ấm ở nhiệt độ 35oC - 37oC/ 18 - 24 giờ. Riêng với phế cầu hoặc
Hemophilus phải có thêm khí trường 5 - 10% CO2.
- Cách đọc kết quả:
+ Mật độ khuẩn lạc: Nơi khơng có KS hoặc có với nồng độ q thấp khơng đủ ức chế được VK, chúng sẽ mọc thành những khuẩn lạc dày sát nhau; nhưng không được mọc thành thảm (quá dày) hoặc cách nhau lưa thưa (quá mỏng), vì mật độ VK quá dày sẽ làm đường kính vùng ức chế thu nhỏ lại và quá mỏng sẽ làm mở rộng vùng ức chế.
+ Đo đường kính vùng ức chế của mỗi khoanh giấy KS bằng thước đo milimet.
- Nhận định kết quả:
+ Nhận định kết quả ở các chủng mẫu bằng cách so vào bảng giới hạn dành cho chủng mẫu để kiểm tra chất lượng xét nghiệm, chất lượng xét nghiệm bao gồm nhiều yếu tố kỹ thuật trong đó có hoạt tính của khoanh giấy