Staphylococcus haemolyticus (2636111) - Streptococci:
+ Streptococcus nhóm viridans:
* Nhuộm Gram: Cầu khuẩn Gram - dương xếp đôi hoặc chuỗi.
* VK không mọc hoặc mọc kém trên các môi trường nuôi cấy thông thường. Trên thạch máu, khuẩn lạc nhỏ như đầu đinh ghim, trong, bóng. Nhiệt độ thích hợp là 37oC có 5% - 10% khí trường CO2.
* Tan máu khơng hồn tồn (anpha). * Optochin (-)
* Xác định tính chất sinh vật hóa học bằng API Strep. Để tủ ấm 37oC/ 24 giờ. Đọc kết quả bằng máy tính cài phần mềm đọc giá đường.
Hình 2.6: Kết quả định danh API Strep số 4605m :
Streptococcus nhóm viridans (4000441)
+ Streptococcus tan máu beta:
* Nhuộm Gram: Cầu khuẩn Gram - dương thường xếp thành chuỗi. * Trên thạch máu gây tan máu hoàn toàn beta.
* Catalase (-)
* Xác định tính chất sinh vật hóa học bằng API Strep. Để tủ ấm 37oC/ 24 giờ. Đọc kết quả bằng máy tính cài phần mềm đọc giá đường.
* Xác định kháng nguyên bằng thử nghiệm ngưng kết với kháng huyết thanh liên cầu để xác định các nhóm A, B, C, D, F, G.
Tính chất vi sinh vật hóa học của liên cầu tan máu beta (nhóm A, B, C và G theo phân loại Lancefield) [31]:
Loài Nhóm Baci tr acin Pyrro lidony- la ryl amidas e CA MP Ar gi ni n VP β - g ala ct os i- dase H ipp ur at e G luc og en Ribose Sorb it ol Treh al ose S. pyogenes A + + - + - - - V - - + S. agalactiae B - - + + - - + - + - + S. dysgalactiae subsp equisimilis C - V - + - - - V + - +
S. equi subsp equi C - - - + - V - + - - V
S. equi subsp
zooepidemicus C - - - + - - - + + + -
S. canis G - - - + - + - - + - -
V: Có thể (+), có thể (-); CAMP (Christie, Atkins, Munch - Petersen): thử nghiệm phân biệt liên cầu nhóm B với các nhóm khác. VP: Voges - Proskauer.
- Enterococci (liên cầu nhóm D):
+ Nhuộm Gram: Cầu khuẩn Gram - dương, xếp thành đôi hoặc thành chuỗi ngắn.
+ Enterococci mọc tốt trên các môi trường: Thạch máu, thạch
chocolate, mọc được trong mơi trường canh thang có 6,5% muối.
+ Một vài chủng của Enterococcus faecalis có thể gây tan máu hoàn toàn (beta).
+ Catalase (-).
+ Lên men đường esculin. - S. pneumoniae:
+ Nhuộm Gram: Cầu khuẩn Gram - dương hình ngọn nến, thường xếp thành đơi.
+ VK mọc dễ dàng trên mơi trường có nhiều chất dinh dưỡng. Trên thạch máu, khuẩn lạc trịn, lõm có núm, hơi xám, xung quanh có vịng tan máu khơng hồn tồn (anpha). Nhiệt độ thích hợp 37oC với khí trường có 5% - 10% CO2.
+ Catalase (-).
+ Optochin (+) (đường kính vịng vô khuẩn > 14mm). + Bị ly giải trong muối mật (thử nghiệm Neufeld (+)).
2.3.4.4 Nhận định kết quả:
- Kết quả cấy máu dương tính:
+ Cấy máu 1 lần: Kết quả dương tính là VK gây bệnh thường gặp. + Cấy máu từ 2 lần trở lên: Kết quả dương tính là tất cả các loại vi sinh vật. - Kết quả cấy máu nhiễm bẩn (dương tính giả):
Trường hợp cấy máu 1 lần mà phân lập được các VK trên da, trong khơng khí:
+ Trực khuẩn Gram - dương (có nha bào và khơng có nha bào) + Staphylococci coagulase (-)
- Kết quả cấy máu âm tính:
Kết quả cấy máu âm tính gồm 2 trường hợp:
+ Dương tính giả: Máy Bactec báo dương tính giả do máu bị vỡ hồng cầu. Trong trường hợp này khơng có VK mọc.
+ Âm tính:
* Sau 4 ngày nếu không thấy dấu hiệu nghi ngờ có VK mọc thì có thể trả lời là “kết quả sơ bộ âm tính sau 4 ngày ni cấy”.
* Sau 5 ngày máy Bactec báo kết quả âm tính: Trả lời kết quả cấy máu là “âm tính sau 5 ngày ni cấy”.
- Tuy nhiên, những trường hợp trên lâm sàng nghi ngờ NTH do nấm thời gian theo dõi phải lâu hơn (10 - 15 ngày).
2.3.4.5 Xác định độ nhạy cảm với KS của VK bằng kỹ thuật khoanh giấy KS khuếch tán trong thạch theo CLSI [34], [43]:
- Nguyên lý:
KS được thấm vào những khoanh giấy với nồng độ nhất định, có đường kính thường là 6mm và được đặt tại một điểm trên mặt đĩa thạch dàn đều VK. KS từ khoanh giấy khuyếch tán ra môi trường xung quanh. Độ khuếch tán phụ thuộc vào tính chất của từng loại KS và độ dày của môi trường. Vì vậy, càng xa nơi đặt khoanh giấy, nồng độ KS càng thấp và ngược lại, càng gần nơi đặt khoanh giấy, nồng độ KS càng cao.
Nơi có KS, VK khơng phát triển được gọi là vùng ức chế (inhibition zone). Đường kính vùng ức chế của từng loại KS tùy thuộc vào quy định của hãng. Khi đo vùng ức chế và so sánh với giới hạn chuẩn sẽ xác định VK nhạy cảm hay đề kháng với KS.
- Mục đích:
Xác định VK nhạy cảm hoặc đề kháng với loại KS nào (định tính). - Cách tiến hành:
+ Chủng VK gây bệnh đã thuần nhất (đã định danh) được cấy vào môi trường nuôi cấy khác nhau tùy thuộc từng loại VK (có thể thạch thường hoặc thạch máu hoặc thạch chocolate) trong 18 - 24 giờ (để lấy chủng VK còn non - chủng đang ở giai đoạn phát triển mạnh nhất).
+ Pha loãng hỗn dịch VK để đạt được huyền dịch VK có độ đục tương đương với độ đục chuẩn 0,5 Mc Farland (tương đương 108 VK/ml).
+ Dùng tăm bông vô trùng thấm ướt huyền dịch vừa pha (độ ẩm vừa phải), ria đều lên mặt đĩa thạch Mueller - Hinton (là môi trường chuẩn để tiến hành kỹ thuật kháng sinh đồ; độ dày thạch là 4 ± 0,5 mm).
+ Đặt các khoanh giấy KS lên mặt thạch đã ria VK, mỗi khoanh giấy cách thành đĩa từ 1,0 - 1,5 mm và cách nhau từ 2,0 - 2,5 mm.
+ Để đĩa thạch ở nhiệt độ phòng 20 phút.
+ Ủ ấm ở nhiệt độ 35oC - 37oC/ 18 - 24 giờ. Riêng với phế cầu hoặc
Hemophilus phải có thêm khí trường 5 - 10% CO2.
- Cách đọc kết quả:
+ Mật độ khuẩn lạc: Nơi khơng có KS hoặc có với nồng độ quá thấp không đủ ức chế được VK, chúng sẽ mọc thành những khuẩn lạc dày sát nhau; nhưng không được mọc thành thảm (quá dày) hoặc cách nhau lưa thưa (quá mỏng), vì mật độ VK quá dày sẽ làm đường kính vùng ức chế thu nhỏ lại và quá mỏng sẽ làm mở rộng vùng ức chế.
+ Đo đường kính vùng ức chế của mỗi khoanh giấy KS bằng thước đo milimet.
- Nhận định kết quả:
+ Nhận định kết quả ở các chủng mẫu bằng cách so vào bảng giới hạn dành cho chủng mẫu để kiểm tra chất lượng xét nghiệm, chất lượng xét nghiệm bao gồm nhiều yếu tố kỹ thuật trong đó có hoạt tính của khoanh giấy KS. Chỉ khi kết quả từ chủng mẫu đạt yêu cầu mới đọc kết quả trên chủng phân lập từ bệnh nhân.
Chủng quốc tế kiểm tra chất lượng:
Escherichia coli ATCC 25922 Staphylococcus aureus ATC 25923 Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853
+ Đo đường kính vùng ức chế của các chủng VK phân lập được từ bệnh nhân, so sánh với “bảng giới hạn đường kính vùng ức chế” theo CLSI để đánh giá mức độ nhạy cảm của VK với KS theo 3 mức độ:
* Nhạy cảm (susceptible): S * Trung gian (intermediate): I
* Đề kháng (resistant): R
Giới hạn xếp loại S, I và R cho một số KS có thể tùy thuộc theo quy định của từng hãng cung cấp khoanh giấy.
2.3.4.6 Xác định VK sinh ESBL bằng kỹ thuật khoanh giấy KS phối hợp với chất ức chế beta - lactamase theo CLSI [43]:
- Nguyên lý: Khi có sự tăng đường kính vùng ức chế của KS cephalosporins thế hệ 3, 4 phối hợp với chất ức chế beta - lactamase (acid clavulanic) so với đường kính của KS cephalosporins cùng loại khơng có phối hợp chất ức chế beta - lactamase (hiệu số ≥ 5 mm) thì có nghĩa ESBL (+).
- Chủng VK xác định sinh ESBL gồm có: E. coli, Klebsiella spp và Proteus mirabilis.
- Phương pháp thực hiện kỹ thuật: Khoanh giấy KS khuếch tán trong thạch. - Môi trường thực hiện kỹ thuật: Môi trường Mueller - Hinton.
- Nồng độ khoanh giấy kháng sinh làm thử nghiệm: + Ceftazidime (CAZ): 30 µg
+ Acid clavulanic (CA): 10 µg
+ Ceftazidime / acid clavulanic (CCAZ): 30 / 10 µg
- Cách tiến hành: Đặt 2 khoanh giấy KS ceftazidime và ceftazidime / acid clavulanic lên mặt thạch đã ria VK, mỗi khoanh giấy cách thành đĩa từ 1,0 - 1,5 mm và cách nhau từ 2,0 - 2,5 mm.
- Điều kiện, thời gian ủ ấm : 35oC - 37oC/ 16 - 18 giờ. - Nhận định kết quả:
+ Đo đường kính vùng ức chế của khoanh giấy KS ceftazidime.
+ Đo đường kính vùng ức chế của khoanh giấy KS ceftazidime / acid clavulanic.
+ Nếu hiệu số giữa đường kính của khoanh giấy KS có phối hợp với acid clavulanic và khoanh giấy KS khơng phối hợp ≥ 5mm thì thử nghiệm xác
định ESBL là dương tính.
(A) (B)
Hình 2.7: Kết quả xác định sinh ESBL (+) số 8322m K. pneumoniae (A) và số 8630m E. coli (B)
Sơ đồ tóm tắt quy trình nghiên cứu
Chai cấy máu (+)
Máy cấy máu tự động BACTEC
Bệnh phẩm (chai cấy máu)
Các môi trường nuôi cấy phân lập đặc hiệu (thạch máu, chocolate, sabauraud) Nhuộm Gram (nhận định sơ bộ hình thể VK) Xác định tên VK gây bệnh Kháng sinh đồ Nhuộm Gram Xác định tính chất sinh vật hóa học bằng giá đường API
2.4 Xử lý và phân tích số liệu
Nhập, xử lý và phân tích số liệu theo phương pháp thống kê, sử dụng phần mềm Whonet 5.4.
Tính tỷ lệ phần trăm (%) và so sánh sự khác biệt về tỷ lệ dựa vào thuật toán kiểm định χ2, với p < 0,05 thì sự khác biệt có ý nghĩa thống kê.
2.5 Vấn đề y đức trong nghiên cứu
Nghiên cứu khoa học vì các mục đích đã nêu ra, nhằm góp phần chăm sóc sức khỏe bệnh nhân ngày một tốt hơn.
2.6 Hạn chế sai số
- Đảm bảo việc chọn đối tượng nghiên cứu đúng tiêu chuẩn. - Giám sát chặt chẽ việc tuân thủ qui trình nghiên cứu.
- Lựa chọn thành viên có đủ năng lực, có kinh nghiệm và trách nhiệm tham gia nhóm nghiên cứu.
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Trong thời gian nghiên cứu từ 01/01/2011 đến 30/06/2011, có 4555 bệnh nhân được chỉ định cấy máu với tổng số 6094 mẫu máu được nuôi cấy.
Kết quả nghiên cứu của chúng tôi như sau:
3.1 Kết quả cấy máu dương tính
3.1.1 Kết quả cấy máu dương tính theo số bệnh phẩm:
Bảng 3.1. Tỷ lệ cấy máu dương tính theo số bệnh phẩm
Kết quả cấy máu Số lượng Tỷ lệ %
Dương tính 567 9,3 Âm tính 5527 90,7 Tổng số 6094 100 9.3% 90.7% Dương tính Âm tính
Biều đồ 3.1. Tỷ lệ cấy máu dương tính theo số bệnh phẩm
Nhận xét: Theo số bệnh phẩm, tỷ lệ cấy máu dương tính là 9,3%. Tỷ lệ cấy máu âm tính là 90,7%.
3.1.2 Kết quả cấy máu dương tính theo số bệnh nhân:
Bảng 3.2. Tỷ lệ cấy máu dương tính theo số bệnh nhân
Kết quả cấy máu Số lượng Tỷ lệ %
Dương tính 397 8,7 Âm tính 4158 91,3 Tổng số 4555 100 8.7% 91.3% Dương tính Âm tính
Biều đồ 3.2. Tỷ lệ cấy máu dương tính theo số bệnh nhân
Nhận xét: Theo số bệnh nhân, tỷ lệ cấy máu dương tính là 8,7%. Tỷ lệ cấy máu âm tính là 91,3%.
3.1.3 Kết quả cấy máu nhiễm bẩn (dương tính giả):
Bảng 3.3. Tỷ lệ cấy máu nhiễm bẩn (dương tính giả)
Kết quả cấy máu Số lượng Tỷ lệ %
Nhiễm bẩn (dương tính giả) 211 3,4 Khơng nhiễm bẩn (dương
tính thật và âm tính thật) 5883 96,6
96,6% 3,4%
Nhiễm bẩn Khơng nhiễm bẩn
Biều đồ 3.3. Tỷ lệ cấy máu nhiễm bẩn (dương tính giả)
Nhận xét: Trong tổng số 778 mẫu bệnh phẩm là các chai cấy máu dương tính, có 72,9% mẫu chai máu có kết quả dương tính thực sự; còn lại 27,1% là tỷ lệ cấy máu bị nhiễm bẩn (dương tính giả). Sự khác biệt này là có ý nghĩa thống kê (p < 0,05).
3.1.4 Kết quả cấy máu dương tính theo các phương pháp lấy máu khác nhau: Bảng 3.4. Tỷ lệ cấy máu dương tính theo các phương pháp Bảng 3.4. Tỷ lệ cấy máu dương tính theo các phương pháp
lấy máu khác nhau
Dương tính Âm tính Thứ tự Cấy máu Phương pháp Số lượng Tỷ lệ % Số lượng Tỷ lệ % Tổng số P A Lấy máu một lần 256 7,8 3008 92,2 3264
B Lấy máu hai vị trí (cùng giờ) 108 11,0 872 89,0 980
A&B P<0,05
C Lấy máu hai lần (cách giờ) 4 6,3 59 93,7 63 B&C P<0,05 D Lấy máu ba lần (cách giờ) 29 11,7 219 88,3 248 B&D P<0,05
7.8 11 6.3 11.7 88.3 93.7 92.2 89 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 A B C D Dương tính Âm tính
Biều đồ 3.4. Tỷ lệ cấy máu dương tính theo các phương pháp lấy máu khác nhau
Nhận xét:
- Tỷ lệ cấy máu (+) theo phương pháp lấy cùng giờ hai vị trí là 11,0%, cao hơn so với cấy máu (+) theo phương pháp lấy máu một lần là 7,8%. Sự khác biệt này là có ý nghĩa thống kê (p < 0,05).
- Tỷ lệ cấy máu (+) theo phương pháp lấy máu hai lần là 6,3%, thấp hơn so với tỷ lệ 11,0% của phương pháp cấy máu cùng giờ hai vị trí. Sự khác biệt này là có ý nghĩa thống kê (p < 0,05).
- Tỷ lệ cấy máu (+) theo phương pháp lấy máu ba lần là 11,7%, cao hơn
so với phương pháp lấy máu hai vị trí cùng giờ 11,0%. Tuy nhiên sự khác biệt này là khơng có ý nghĩa thống kê (p < 0,05).
Phương pháp cấy máu Tỷ lệ (%)
3.2 Kết quả phân lập các căn nguyên gây bệnh
3.2.1 Kết quả phân lập căn nguyên gây bệnh theo nhóm vi sinh vật: Bảng 3.5. Tỷ lệ phân lập căn nguyên theo nhóm vi sinh vật Bảng 3.5. Tỷ lệ phân lập căn nguyên theo nhóm vi sinh vật
Căn nguyên Số lượng Tỷ lệ % P
Vi khuẩn 358 90,1 Nấm 39 9,9 Tổng số 397 100 <0,05 90.1% 9.9% Vi khuẩn Nấm
Biều đồ 3.5. Tỷ lệ phân lập căn nguyên theo nhóm vi sinh vật
Nhận xét: Tỷ lệ cấy máu dương tính do căn nguyên VK chiếm 90,1%, cao hơn rất nhiều so với căn nguyên gây bệnh là nấm có 9,9%. Sự khác biệt này là có ý nghĩa thống kê (p < 0,05).
3.2.2 Kết quả phân lập VK gây NTH theo nhóm VK:
Bảng 3.6. Tỷ lệ phân lập VK gây NTH theo nhóm VK
Nhóm vi khuẩn Số lượng Tỷ lệ % P VK Gram - âm 227 63,4 VK Gram - dương 131 36,6 Tổng số 358 100 <0,05 36.6% 63.4% VK Gram - âm VK Gram - dương
Biều đồ 3.6. Tỷ lệ phân lập VK gây NTH theo nhóm VK
Nhận xét: Kết quả bảng 6 và biểu đồ 6 cho thấy tỷ lệ NTH do VK Gram - âm là 63,4%. Tỷ lệ NTH do VK Gram - dương thấp hơn có 36,6%. Sự khác biệt này là có ý nghĩa thống kê (p < 0,05).
3.2.3 Kết quả phân lập các loại VK Gram - âm:
Bảng 3.7. Tỷ lệ phân lập các loại VK Gram - âm
Vi khuẩn Tỷ lệ % P Số lượng 176 77,5 Các VK đường ruột E. coli Klebsiella spp Serratia marcescens Salmonella spp Các VK đường ruột khác 85 32 29 16 14 37,4 14,1 12,8 7,0 6,2 Số lượng 21 9,4 P. aeruginosa và các Pseudomonas khác P. aeruginosa B. pseudomallei Pseudomonas khác 6 9 6 2,7 4,0 2,7 Số lượng 14 6,2 Acinetobacter A. baumannii A. junii 12 2 5,3 0,9 Các VK Gram - âm khác Số lượng 16 6,9 Tổng số 227 100 <0,05
77.5 9.4 6.2 6.9 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Các vi khuẩn đường ruột P. aeruginosa và các Pseudomonas khác
Acinetobacter Các VK Gram - âm khác
Biểu đồ 3.7. Tỷ lệ phân lập các loại VK Gram - âm
Nhận xét: Trong số các VK Gram - âm gây bệnh, các VK đường ruột chiếm tỷ lệ cao nhất 77,5%. Trực khuẩn mủ xanh và các Pseudomonas khác chỉ chiếm 9,4%. Acinetobacter chiếm tỷ lệ thấp nhất 6,2%. Ngoài ra là các VK Gram - âm khác chiếm tỷ lệ 6,9% (Achromobacter xylosoxidans 3,5%,
Aeromonas hydrophila 1,3%, Stenotrophomonas maltophilia 0,9%, Alcaligenes faecalis 0,4%, Chromobacterium violaceum 0,4%, Ralstonia pickettii 0,4%). Sự khác biệt này là có ý nghĩa thống kê (p < 0,05). Với riêng
từng loại VK, căn nguyên hay gặp nhất là E. coli 37,4%, tiếp đến là Klebsiella
spp với 14,1%, Serratia marcescens là 12,8%. P. aeruginosa và A. baumannii
trong nghiên cứu này lần lượt có tỷ lệ 2,7% và 5,3%. Các VK cịn lại cũng