2.3 Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Thiết kế nghiên cứu:
Nghiên cứu mô tả cắt ngang.
2.3.2 Phương pháp chọn mẫu:
Tiêu chuẩn lấy mẫu:
- Các bệnh nhân nằm điều trị tại các khoa của bệnh viện Bạch Mai có nghi ngờ NTH, được bác sỹ lâm sàng chỉ định cấy máu.
- Các mẫu bệnh phẩm được lấy đủ số lượng máu quy định và có đầy đủ thông tin của bệnh nhân trên giấy xét nghiệm và trên chai máu.
- Các chai cấy máu sau khi lấy được gửi ngay đến phòng xét nghiệm khoa Vi sinh bệnh viện Bạch Mai trong vòng 2 giờ và các mẫu bệnh phẩm này không được giữ trong tủ lạnh.
- Các chủng VK nuôi cấy được từ máu tiếp tục được định danh theo thường quy của WHO.
- Các chủng VK đã định danh được thử nghiệm KS đồ bằng phương pháp Kirby - Bauer (kỹ thuật khoanh giấy KS khuếch tán).
- Các chủng VK được xác định sinh ESBL bằng phương pháp đặt khoanh giấy KS phối hợp với chất ức chế beta - lactamase.
2.3.3 Biến số và chỉ số nghiên cứu:
- Tỷ lệ cấy máu dương tính. - Tỷ lệ cấy máu nhiễm bẩn.
- Tỷ lệ cấy máu dương tính theo các phương pháp lấy máu. - Tỷ lệ các loại VK gây NTH.
- Tỷ lệ các loại nấm gây NTH.
- Đánh giá mức độ kháng KS của các chủng VK phân lập được.
2.3.4 Phương pháp nghiên cứu:
2.3.4.1 Ủ ấm và theo dõi chai cấy máu:
- Ủ ấm:
Chai cấy máu sau khi chuyển đến phòng xét nghiệm được ủ ấm ngay lập tức bằng hệ thống máy cấy máu tự động Bactec 9240 (chứa tối đa 240 chai): Quét mã số của chai cấy máu và đưa chai máu vào vị trí đã quy định.
- Theo dõi chai cấy máu:
+ Chai cấy máu được theo dõi hàng ngày nhờ hệ thống máy cấy máu tự động Bactec.
+ Máy cấy máu tự động ủ và lắc liên tục. Đèn huỳnh quang trong máy quét 10 phút/ lần vào lớp màng ở đáy chai để phát hiện nồng độ CO2. Nếu có sự phát triển của VK, CO2 sẽ được giải phóng ra mơi trường, máy Bactec phát hiện được sẽ báo kết quả dương tính. Máy Bactec có thể phát hiện sự có mặt của VK sớm nhất sau 2 giờ.
2.3.4.2 Phân lập VK:
- Dùng kim tiêm vô trùng hút một giọt cấy vào môi trường thạch máu. Ria đều. Để tủ ấm 37oC có 5 - 10% khí trường CO2 trong 24 giờ.
- Nhỏ một giọt máu lên lam kính nhuộm Gram quan sát hình thể VK. - Sau 24 giờ:
+ Có VK mọc ở thạch máu: Định danh VK
+ Khơng có VK mọc ở thạch máu: Lấy máu từ chai cấy lại vào môi trường chocolate và 2 ống sabauraud.
* Ủ ấm môi trường chocolate và một ống sabauraud ở 37oC có 5 - 10% CO2 trong 24 giờ.
* Để ống sabauraud còn lại theo dõi ở nhiệt độ phòng. - Sau 48 giờ:
+ Khơng có VK, nấm mọc: Tiếp tục nuôi cấy thêm 24 giờ nữa. + Có VK hoặc nấm mọc: Định danh VK, nấm.
- Sau 72 giờ:
+ Khơng có VK, nấm mọc: Trả lời kết quả âm tính. + Có VK, nấm mọc: Định danh VK, nấm.
2.3.4.3 Xác định tên vi khuẩn gây bệnh theo các tiêu chuẩn chẩn đoán [46]:
- Họ VK đường ruột Enterobacteriaceae: + Nhuộm Gram: Trực khuẩn Gram - âm + Ưa khí hoặc kỵ khí tùy tiện
+ Khuẩn lạc dạng S + Oxydase (-)
+ Có thể di động hoặc khơng di động + Không sinh nha bào
+ Xác định tính chất sinh vật hóa học bằng API E. Để tủ ấm 37oC/ 24 giờ. Đọc kết quả bằng máy tính cài phần mềm đọc giá đường.