Yếu tố tiên lƣợng Phân loại Nguy cơ
Tuổi ≤ 60 tuổi Nguy cơ chuẩn
> 60 tuổi Nguy cơ cao
Lƣợng huyết sắc tố < 70 g/L Nguy cơ cao
≥ 70 g/L Nguy cơ chuẩn
Số lƣợng tiểu cầu < 100 G/L Nguy cơ cao
≥ 100 G/L Nguy cơ chuẩn
Số lƣợng BCTT < 1 G/L Nguy cơ cao
≥ 1 G/L Nguy cơ chuẩn
Blast ngoại vi Khơng Nguy cơ chuẩn
Cĩ Nguy cơ cao
Blast tủy xƣơng ≤ 5% Nguy cơ chuẩn
> 5% Nguy cơ cao
Di truyền tế bào Rất tốt Tốt Trung bình Xấu Rất xấu IPSS-R Rất thấp Thấp Trung bình Cao Rất cao
2.2.4. Vật liệu và các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu
2.2.4.1. Vật liệu nghiên cứu
- 2 ml máu tĩnh mạch hoặc dịch tủy xương được cho vào ống chống đơng bằng EDTA để xét nghiệm các chỉ số máu ngoại vi, tủy xương, di truyền phân tử
- 2 ml máu tĩnh mạch hoặc dịch tủy xương được cho vào ống chống đơng bằng Heparin để xét nghiệm di truyền tế bào
- Bảo quản mẫu 2-8oC, giao mẫu đến khoa xét nghiệm trong vịng 24 giờ kể từ khi lấy mẫu.
2.2.4.2. Kỹ thuật lấy mẫu bệnh phẩm
- Kỹ thuật lấy máu ngoại vi, chọc hút tủy xương và sinh thiết tủy xương (*).
2.2.4.3. Kỹ thuật xét nghiệm tế bào học
- Kỹ thuật nhuộm Giêmsa tiêu bản máu và tủy xương dàn (*). - Kỹ thuật nhuộm hồng cầu sắt (nhuộm Perls) (*).
- Kỹ thuật xử lý mảnh sinh thiết tủy xương và nhuộm HE (Hemophylic eosin) tiêu bản tổ chức học tủy xương (*).
2.2.4.4. Kỹ thuật xét nghiệm di truyền tế bào
- Kỹ thuật nuơi cấy và phân tích NST tủy (*)
- Kỹ thuật FISH (Fluorescent in-situ hybridization): lai huỳnh quang
tại chỗ (*) xác định một số bất thường: del(5q), -7/del(7q), del(20q).
2.2.4.5. Kỹ thuật xét nghiệm di truyền phân tử
- Trong nghiên đề tài luận án, giai đoạn đồn đầu của nghiên cứu chúng tơi xây dựng qui trình giải trình tự gen đích NGS với 4 gen đặc trưng cho HCRLST là: SF3B1, TET2, ASXL1 và DMNT3A. Giai đoạn 2,
nghiên cứu sử dụng bộ sinh phẩm “Hema 50 Panel” của nhà sản xuất Dxome.
Bảng 2.8. Trình tự mồi thiết kế nhân các gen SF3B1, TET2, ASXL1 và DMNT3A
Tên gen Tên mồi Trình tự mồi
SF3B1 SF3B1_F1 GTTCCGTCTGTGTGTTCGAG SF3B1_R1 AAAGCAGCCAAACCCTTTCC SF3B1_F2 AAAGTTCGGACCATCAGTGC SF3B1_R2 GTTCTTGGTCACTACTGGCATT TET2 TET2_F1 GCAAACATTCAGCAGCACAC TET2_R1 TGTGTTTGTGCTGCCTGTTT TET2_F2 GCACTTCTCCAAAACAGACCA TET2_R2 GTTGTGCAAGTCTCTGTGGG TET2_F3 TGAACACAGAGCACCAGAGT TET2_R3 TGACAGGTTGGTTGTGGTCT TET2_F4 TCCATATGCCTTCACTCGGG ASXL1 ASXL1_F1 GTGACCTCTGACCCCGTG ASXL1_R1 TTGGGCTCCTCTTTAGTGGG ASXL1_F2 AGTCTGTGGCTTCTCGGATC ASXL1_R2 GCAATTCTTTTGGGGTGCTC ASXL1_F3 AGCATGTCAGAATCCCCACA ASXL1_R3 CAGGGAGGATGTCAAGCAGA DMNT3A DNMT3A_F1 CTGACAGAGGCACCGTTCA DNMT3A_R1 GGTCAAATTCCTGGTCGTGG DNMT3A_F2 AAGACCCCTGGAACTGCTAC DNMT3A_R2 GCTCCCAAGTTCTCCTCCTT
- Nguyên lý kỹ thuật NGS: DNA đích được phân cắt thành các đoạn
nhỏ cĩ kích thước khoảng 300-500bp, được gắn mã phân biệt và đưa vào giải trình tự một cách đồng thời. Dựa trên nguyên lý cơ bản sinh tổng hợp chuỗi DNA bổ sung, sử dụng các dNTP tự do cĩ gắn huỳnh quang đặc hiệu theo nguyên lý vừa sinh tổng hợp vừa giải trình tự (Sequencing by Synthesis)
- Các bƣớc tiến hành:
+ Tách DNA sử dụng bộ sinh phẩm Mag-Bind® Blood & Tissue DNA HDQ 96.
+ Đo và chuẩn hĩa nồng độ DNA sử dụng bộ sinh phẩm QuBit dsDNA HS Assay kit (với tiêu chuẩn A260/A280 từ 1,8 đến 2,0),
+ Pha lỗng các mẫu đến nồng độ 0,2 ng/µl bằng dung dịch EB + Phân mảnh DNA ngẫu nhiên bằng enzyme
+ Gắn mã phân biệt cho thư viện DNA bằng enzyme ligase.
+ Tinh sạch sản phẩm thư viện DNA sử dụng hạt từ (micro magnetic bead), sản phẩm thu được là các đoạn DNA cĩ độ tinh sạch cao, đáp ứng yêu cầu NGS
+ Đo nồng độ thư viện sử dụng bộ sinh phẩm QuBit dsDNA HS AssayKit
+ Quy đổi nồng độ các mẫu từ đơn vị ng/µl sang đơn vị nM
+ Quy đổi nồng độ các mẫu từ đơn vị ng/µl sang đơn vị nM theo cơng thúc như sau:
X: Nồng độ (nM) của mẫu Y: Nồng độ (ng/µl) của mẫu M: kích thước đoạn DNA
+ Pha lỗng và chuẩn hĩa mẫu: Pha lỗng nồng độ các mẫu về 4 nM sử dụng EB (Ellution Buffer)
+ Chạy giải trình tự sử dụng bộ sinh phẩm Miseq Reagent kit
+ Phân tích kết quả giải trình tự tên phần mềm Miseq Reporter và CLC genomic workbench. Các sai khác trên DNA của mẫu phân tích được ghi nhận, tra cứu và đối chiếu trên cơ sở dữ liệu đột biến ClinVar (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/).
Lưu ý: (*) Các qui trình kĩ thuật theo"Hướng dẫn chẩn đốn và điều trị
một số bệnh lý huyết học" của Bộ Y tế ban hành năm 2015. 2.2.4.6. Phương pháp thu thập số liệu
- Tra cứu số liệu qua hồ sơ bệnh án.
- Điều tra viên: nghiên cứu viên chính của đề tài trực tiếp thu thập số liệu. Nghiên cứu viên chính cũng trực tiếp tham gia chẩn đốn, điều trị bệnh nhân HCRLST.
2.2.4.7. Một số thiết bị
- Kính hiển vi quang học
- Máy tính được kết nối phần mềm Labconn, máy in, đầu đọc barcode. - Máy đếm tế bào tự động DxH 800, DxH900, ADVIA2120i, XN 1000. - Máy nhuộm tiêu bản tự động: DxH Slidemaker Stainer, ADVIA Auto
slide
- Bàn đếm cơng thức bạch cầu
- Hệ thống phân tích bộ nhiễm sắc thể Ikaros và Isis MataSystems - Máy tách ADN/ARN bán tự động KingFisher Flex
- Máy đo nồng độ ADN/ARN QuBit 2.0 - Máy giải trình tự NGS Illumina MiSeq.
2.2.5. Các phác đồ sử dụng trong nghiên cứu
2.2.5.1. Phác đồ điều trị hỗ trợ
- Điều trị hỗ trợ, bao gồm: truyền chế phẩm máu, thải sắt, dùng kháng sinh khi cĩ nhiễm trùng, các yếu tố kích thích tăng trưởng dịng hồng cầu, bạch cầu hạt (30 ngày/chu kỳ).
- Đánh giá sau mỗi đợt điều trị: mức độ đáp ứng, thời gian OS, PFS và tác dụng khơng mong muốn.
- Việc đánh giá đáp ứng điều trị được thực hiện sau 6 tháng hoặc khi phát hiện các bất thường.
- Chỉ định dùng kháng sinh khi cĩ nhiễm trùng (sốt, mơi khơ, lưỡi bẩn, cấy máu dương tính, Lactat, procalcitonin tăng…)
- Thải sắt khi nồng độ ferritin huyết thanh > 1000µg/L Thuốc sử dụng: Desferal 500 mg
Liều dùng: 50 mg/kg/ngày
- Dùng các yếu tố kích thích tăng trưởng (Epo ± G-CSF)
Chỉ định khi HBG 80 – 100 g/l và sEPO ≤ 500 U/L, giá trị tuyệt đối bạch cầu trung tính < 1,5 G/l
Liều dùng: EPO 60.000 UI/tuần, G-CSF 300 µg/tuần - Chỉ định truyền khối hồng cầu: khi HBG < 80 g/l.
- Chỉ định truyền khối tiểu cầu: số lượng tiểu cầu < 20 G/L hoặc < 50 G/L cĩ chảy máu.
2.2.5.2. Điều trị decitabine
- Điều trị bằng decitabine: decitabine với liều 20 mg/m2/ngày, truyền tĩnh mạch trong 1 giờ mỗi ngày và liên tục trong 5 ngày (tổng cộng 5 liều cho mỗi chu kỳ), tối thiếu 4 chu kỳ và tối đa 9 chu kỳ.
- Đánh giá sau mỗi đợt điều trị: mức độ đáp ứng, thời gian OS, PFS và tác dụng khơng mong muốn.
- Việc đánh giá đáp ứng điều trị được thực hiện sau 4 chu kỳ điều trị hoặc khi phát hiện các bất thường.
2.2.6. Qui trình nghiên cứu
2.2.6.1. Thu thập thơng tin trước điều trị
Lâm sàng
- Tuổi, giới
- Triệu chứng tồn thân: Mệt mỏi, chán ăn, gày sút, sốt, xuất huyết, thiếu máu.
- Bệnh sử trước đĩ
Cận lâm sàng
- Các xét nghiệm thường qui trước điều trị: cơng thức máu, sinh hố (ure, creatinine, ALT, AST…) trước mỗi đợt điều trị.
- Xét nghiệm tủy đồ, sinh thiết tủy xương tại thời điểm chẩn đốn, sau điều trị mỗi 4 tháng hoặc cĩ phát hiện bất thường.
- Xét nghiệm di truyền tế bào và đột biến phân tử: + Vị trí lấy bệnh phẩm: lấy từ tủy xương
+ Các xét nghiệm tìm bất thường di truyền tế bào và đột biến phân tử của các bệnh nhân được làm tại Khoa Di truyền - Sinh học phân tử, Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương.
2.2.6.2. Điều trị
- 37 bệnh nhân đồng ý điều trị với phác đồ điều trị hỗ trợ, bao gồm: truyền chế phẩm máu, thải sắt, dùng kháng sinh khi cĩ nhiễm trùng, các yếu tố kích thích tăng trưởng dịng hồng cầu, bạch cầu hạt.
- 49 bệnh nhân đồng ý điều trị với phác đồ đơn hĩa trị decitabine với liều 20 mg/m2/ngày, truyền tĩnh mạch trong 1 giờ mỗi ngày và liên tục trong 5 ngày (tổng cộng 5 liều cho mỗi chu kỳ), lặp lại sau mỗi 4 tuần, tối thiểu 4 chu kỳ tối đa 9 chu kỳ.
- Việc lựa phân nhĩm bệnh nhân điều trị dựa trên tiêu cuẩn IPSS-R. - Mọi can thiệp và khoảng thời gian chậm trễ đều được ghi nhận.
2.2.6.3. Đánh giá hiệu quả điều trị và tác dụng phụ
1) Đánh giá hiệu quả điều trị
- Bao gồm: Đánh giá sự thay đổi chỉ số huyết học của tế bào máu ngoại vi, tủy xương và mối liên quan giữa đáp ứng với một số yếu tố
- Thời điểm đánh giá: sau 4 chu kỳ điều trị hoặc khi phát hiện các bất thường.
- Phương pháp đánh giá: Thu thập thơng tin lâm sàng, cận lâm sàng như trước điều trị, đánh giá theo IWG 2018.
2) Đánh giá thời gian sống thêm a) Xác định các mốc thời gian
- Ngày bắt đầu điều trị
- Ngày xuất hiện bệnh tiến triển khi đánh giá đáp ứng khách quan - Ngày bệnh nhân tử vong
- Ngày cĩ thơng tin cuối cùng
- Ngày kết thúc nghiên cứu (8.2021).
b) Thời gian sống thêm bệnh khơng tiến triển (PFS)
- Định nghĩa: Là khoảng thời gian tính từ khi bắt đầu điều trị đến khi bệnh tiến triển qua đánh giá đáp ứng khách quan (đối với bệnh nhân tử vong hoặc mất thơng tin mà khơng cĩ bệnh tiến triển được xem như cĩ bệnh tiến triển tại thời điểm tử vong hoặc mất thơng tin).
- Cách tính: Thời gian sống thêm bệnh khơng tiến triển (tháng) = (ngày cĩ thơng tin cuối, ngày bệnh tiến triển – ngày bắt điều trị)/24.
- Xác định các giá trị trung vị, các xác suất sống thêm khơng tiến triển tại thời điểm sau mỗi 4 tháng hoặc khi phát hiện các bất thường.
- Phân tích mối liên quan giữa sống thêm khơng tiến triển với một số yếu tố: giới, tuổi, nhĩm phân loại IPSS-R, nhĩm nguy cơ di truyền tế bào, phác đồ đã điều trị.
c) Thời gian sống thêm tồn bộ (OS)
- Định nghĩa: Là khoảng thời gian tính từ ngày bắt đầu điều trị cho đến thời điểm rút khỏi nghiên cứu: Ngày chết do bệnh, ngày mất theo dõi, ngày khám bệnh cuối cùng cịn sống, sau đĩ khơng cịn thơng tin khác hay ngày chết do các nguyên nhân khác.
- Cách tính: Thời gian sống thêm tồn bộ (tháng) = (ngày cĩ thơng tin cuối, ngày chết - ngày bắt đầu điều trị)/24.
- Xác định các giá trị trung vị, các xác suất sống tồn bộ tại thời điểm sau mỗi 4 tháng hoặc khi phát hiện các bất thường.
- Phân tích mối liên quan giữa sống thêm tồn bộ với một số yếu tố: giới, tuổi, nhĩm phân loại theo IPSS-R, nhĩm nguy cơ theo di truyền tế bào, phác đồ đã điều trị.
3) Đánh giá các yếu tố liên quan đến điều trị:
- Để tìm hiểu mối liên quan tới đáp ứng điều trị chúng tơi phân tích hồi qui nhị phân đơn biến các yếu tố tiên lượng dựa trên hai nhĩm đáp ứng. Thứ nhất là nhĩm đáp ứng gồm: đáp ứng hồn tồn, đáp ứng một phần, đáp ứng hồn tồn tủy và cải thiện huyết học. Thứ hai là nhĩm khơng đáp ứng gồm: bệnh ổn định và thất bại.
4) Đánh giá độc tính
- Ghi nhận độc tính trước mỗi đợt điều trị hoặc khi cĩ dấu hiệu lâm sàng. - Đánh giá độc tính trên huyết học, chức năng gan thận, da và trên các
cơ quan khác theo tiêu chuẩn đánh giá độc tính của NCI (National Cancer Institute Common Toxicity Criteria) phiên bản 2.0.
2.2.7. Sơ đồ nghiên cứu
Biểu đồ 2.1. Sơ đồ nghiên cứu 2.2.8. Phân tích và xử lí số liệu 2.2.8. Phân tích và xử lí số liệu
- Các thơng tin được thu thập qua bệnh án nghiên cứu theo bộ câu hỏi đã thiết kế sẵn (xem thêm phần phụ lục)
- Các thơng tin thu thập được mã hố và xử lý trên phần mềm SPSS 16.0 - Phân tích đa biến bằng phần mềm SPSS 16.0
- Phân tích thời sống thêm theo phương pháp Kaplan-Meier (phương pháp ước tính xác suất chuyên biệt, áp dụng cho các dữ liệu quan sát chưa hồn tất).
- Phân tích các yếu tố ảnh hưởng đến sống thêm và nguy cơ tử vong: Phân tích đơn biến sử dụng test Log-rank khi so sánh sự khác biệt về
khả năng sống thêm với một số yếu tố. Phân tích đa biến sử dụng mơ hình hồi qui Cox với độ tin cậy 95% (p = 0,05). Các biến độc lập gồm thời gian sống thêm tồn bộ và thời gian sống thêm bệnh khơng tiến triển. Các biến phụ thuộc gồm: tuổi, giới, các biến phân loại của tế bào máu ngoại vi và tủy xương (lượng huyết sắc tố, số lượng tiểu cầu, số lượng bạch cầu trung tính, tỉ lệ blast…), tiên lượng di truyền tế bào, IPSS-R,…
- Các thuật tốn thống kê:
+ Trung bình, độ lệch chuẩn, giá trị max, min - Kiểm định so sánh:
+ Với các biến định tính: Sử dụng test so sánh khi bình phương, các so sánh cĩ ý nghĩa thống kê khi p < 0,05. Trong trường hợp giá trị mong đợi nhỏ hơn 5 thì sử dụng test khi bình phương với hiệu chỉnh Fisher.
+ So sánh các giá trị trung bình trước và sau điều trị bằng test t ghép cặp với kiểm định Wilcoxon.
+ Kiểm định so sánh sự khác biệt về khả năng sống thêm với một số yếu tố liên quan bằng kiểm định Log-rank.
+ Sử dụng phương trình hồi quy tỷ suất nguy cơ Cox (phân tích đa biến) với độ tin cậy 95% nhằm khảo sát các yếu tố nguy cơ ảnh hưởng đến thời gian sống thêm.
2.3. Đạo đức trong nghiên cứu
- Lợi ích của nghiên cứu: Biện pháp điều trị trong nghiên cứu đã được thử nghiệm lâm sàng ở nhiều trung tâm lớn trên thế giới và được áp dụng rộng rãi ở nhiều nước phát triển. Nghiên cứu biện pháp điều trị này với mục đích kiểm sốt bệnh tốt, cải thiện triệu chứng, nâng cao
chất lượng sống và kéo dài thời gian sống thêm cho bệnh nhân hội chứng rối loạn sinh tủy.
- Tính tự nguyện: Tất cả bệnh nhân trong nghiên cứu đều hồn tồn tự nguyện tham gia. Nghiên cứu chỉ nhằm mục đích nâng cao chất lượng điều trị, khơng nhằm mục đích nào khác. Tất cả các thơng tin chi tiết về tình trạng bệnh tật, các thơng tin cá nhân của người bệnh được bảo mật thơng qua việc mã hố số liệu trên máy vi tính. Thuốc trong nghiên cứu đa phần được bảo hiểm chi trả, decitabine quỹ bảo hiểm chi trả 50%. - Nghiên cứu được chấp thuận của Hội đồng đạo đức trong nghiên cứu y
sinh học của Trường Đại học Y Hà Nội, quyết định số 77/ HĐĐĐĐHYHN ngày 30/5/2017.
- Nghiên cứu được chấp thuận của Hội đồng đạo đức trong nghiên cứu y sinh học của Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương, quyết định số 939/QĐ - HHTM ngày 31/5/2019.
2.4. Sai số nghiên cứu và biện pháp khắc phục sai số
2.4.1. Sai số
- Sai số do xét nghiệm: Sai số trong quá trình trước, trong và sau xét nghiệm. - Sai số do thu thập và xử lý số liệu: Sao chép và ghi kết quả khơng
chính xác.
2.4.2. Biện pháp khắc phục sai số
- Chuẩn hĩa kỹ thuật. - Tập huấn thu thập số liệu.
Chƣơng 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Đặc điểm nhĩm bệnh nhân nghiên cứu
3.1.1. Đặc điểm về tuổi và giới
Từ tháng 11/2017 đến tháng 8/2021, nghiên cứu đã tiến hành thu thập dữ liệu 139 bệnh nhân hội chứng rối loạn sinh tủy tại bệnh viện Bạch Mai và Viện Huyết học – Truyền máu Trung ương. Trong đĩ, 34 bệnh nhân được