pETM-p16(B; pSUMO-p16(C); pGAT-p16 (D).Giếng 1: Thang kích thước DNA (1kb). Giếng 2:Chứng âm. Giếng 3: Chứng dương. Giếng 4: Sản phẩm PCR từ plasmid tái tổ hợp.
B 1 2 3 4 500bp 250bp A 2 3 4 1 500bp 250bp
36
Hình 12. Sản phẩm PCR từ các plasmid tái tổ hợp mang gene L1 HPV16 (A) và L1 HPV 18(B). Giếng 1: Thang kích thước DNA (1kb). Giếng 2: Chứng âm. Giếng 3: Chứng dương. Giếng 4, 5, 6: Sản phẩm PCR từ plasmid tái tổ hợp lần lượt với các cặp mồi: mồi xuôi đặc hiệu- mồi ngược đặc hiệu, mồi xuôi đặc hiệu-mồi T7 terminator, mồi T7 promoter-mồi ngược đặc hiệu.
4.1.3. BIỂU HIỆN PROTEIN TÁI TỔ HỢP VÀ KIỂM TRA CHÚNG BẰNG SDS- PAGE VÀ WESTERN BLOT
Chúng tôi biến nạp các plasmid tái tổ hợp vào chủng E.coli BL21 (DE3). Chủng
E.coli BL21 (DE3) mang các plasmid tái tổ hợp được cảm ứng ở 370C trong 6 giờ với 0,5mMIPTG. Kết quả biểu hiện protein tái tổ hợp được kiểm tra bằng phương pháp điện di SDS-PAGE và Western blot với KTĐD kháng protein E7 HPV 16 (hình 13) và p16INK4A (hình 14).
4.1.3.1 Kết quả biểu hiện protein E7 HPV 16
Kết quả điện di SDS-PAGE (hình 13 A1,2,3,4) cho thấy ở chủng BL21 mang các vector tái tổ hợp được cảm ứng (giếng 5) có sự xuất hiện với mức biểu hiện vượt trội của một protein không thấy ở các mẫu mang vector không tái tổ hợp hoặc mang vector tái tổ hợp nhưng không được cảm ứng.
Các protein mục tiêu có kích thước lớn hơn dự đoán đối với protein E7 HPV 16 biểu hiện ở dạng dung hợp với các đi khác nhau theo tính tốn lý thuyết (bảng 7).
Bảng 7. Phân tử lượng dự đốn của protein E7 HPV16 dung hợp với các đi khác nhau.
Hệ vector Dạng dung hợp của protein
E7 HPV16
Kích thước dự đốn
Kích thước trên gel polyacrylamide 12%
pET-28a(+) 6xHis-E7 14 kDa 20 kDa
pETM-44 6xHis-protein MBP-E7 51 kDa 57 kDa
pE-SUMO3 6xHis- protein SUMO –E7 30 kDa 36 kDa
37 A1 B1 A2 B2 A3 B3 B4 A4
Hình 13. Kết quả SDS-PAGE (A ) và Western blot (B) từ các vector pET-E7 (1), pETM-E7 (2), pSUMO-E7 (3), pGAT-E7 (4). Giếng 1: Thang phân tử lượng protein. Giếng 2,3: Protein tổng
của E.coli BL21 (DE3) mang các vector nguyên thủy không được và được cảm ứng.Giếng 4,5: Protein tổng từ E.coli BL21 (DE3) mang các vector tái tổ hợp không được và được cảm ứng: Giếng 6,7: phân đoạn protein thể vùi và thể tan từ chủng BL21mang các vector tái tổ hợp được
cảm ứng.
Sự khác biệt này đã được Moro và cộng sự (1996) ghi nhận. Cơng trình này cho thấy sự di chuyển của một polypeptide trong gel polyacrylamide phụ thuộc vào tương tác giữa nó với các phân tử SDS. Sự hiện diện của các amino acid giàu điện tích âm trong chuỗi polypetide sẽ cản trở tương tác này. Đặc biệt, sự hiện diện của hai amino acid tích điện âm, glutamic acid hay aspartic acid, liền kề nhau sẽ hạn chế sự liên kết giữa SDS và chuỗi polypeptide khiến chuỗi polypeptide di chuyển chậm trong gel. Protein E7 HPV 16 có thành phần glutamic và aspartic acid lần lượt là 9,18 % và 10,2 % và có một vùng, từ amino acid thứ 33 đến amino acid thứ 37, giàu glutamic và aspartic acid. Mặt khác, protein E7 HPV16 cịn có proline với tỉ lệ 6,12 % có khả năng tăng tính bền của cấu trúc protein khiến cho protein càng khó hình thành phức hợp với phân tử SDS.
Kết quả Western blot (hình 13 B1,2,3,4) với kháng thể đặc hiệu cho protein E7 HPV16 cho thấy có vạch tín hiệu lai tương ứng với kết quả điện di SDS-PAGE.
38
4.1.3.2. Kết quả biểu hiện protein p16INK4A
Kết quả phân tích bằng phương pháp SDS-PAGE (hình 14 A1,2,3,4) cho thấy ở
chủng vi khuẩn tái tổ hợp mang gene p16INK4A được cảm ứng (giếng 5) xuất hiện một
vạch protein không thấy ở những mẫu không được cảm ứng hoặc khơng mang vector tái
tổ hợp. Tín hiệu này phù hợp với kích thước dự đốn của protein p16INK4A ở trạng thái
dung hợp với các đi khác nhau được trình bày ở bảng 8.
Kết quả Western blot (hình 14 B1,2,3,4) với kháng thể kháng p16INK4A trên các
vector tái tổ hợp với KTĐD đặc hiệu cho p16INK4A đều cho tín hiệu lai ở vị trí tương ứng
với phân tử lượng của protein p16INK4A ở dạng dung hợp với các đi khác nhau.
Hình 14. Kết quả SDS-PAGE (A) và Western blot (B) từ các vector pET-p16 (1), pETM-p16 (2), pSUMO-p16 (3), pGAT-p16 (4). Giếng 1: Thang phân tử lượng protein. Giếng 2,3: Protein tổng số từ E.coli BL21 (DE3) mang các vector nguyên thủy không được và được cảm ứng.Giếng 4,5: Protein tổng từ E.coli BL21 (DE3) mang các vector tái tổ hợp không được và được cảm ứng.
Giếng 6,7: phân đoạn protein thể vùi và thể tan từ chủng BL21mang các vector tái tổ hợp được cảm ứng.
A1 B1
A2 B2
A3 B3
39
Bảng 8. Kích thước dự đốn của protein p16INK4A ở dạng dung hợp với các đuôi khác nhau
Hệ vector Trạng thái dung hợp của protein p16INK4A Kích thước dự đốn
pET28a(+) 6xHis-p16INK4A 18,7 kDa
pETM44 6xHis-protein MBP-p16INK4A 57 kDa
pSUMO3 6xHis- protein SUMO -p16INK4A 34 kDa
pGAT 6xHis- protein GST -p16INK4A 43 kDa
Kết quả SDS-PAGE và Western blot (hình 14) cho thấy chúng tôi đã biểu hiện
thành công protein E7 HPV16 và p16INK4A tái tổ hợp ở dạng dung hợp với các đuôi 6xHis
(pET28a(+)), 6xHis-MBP (pETM-44), 6xHis-SUMO (pSUMO3), 6xHis-GST (pGAT).
4.1.3.3. Kết quả biểu hiện protein E7 HPV 6 và E7 HPV 11
Kết quả điện di SDS-PAGE và Western blot với kháng thể kháng His (đối với E7 HPV 6) (hình 15 A, B) và kháng thể đặc hiệu (E7 HPV 11) (hình 15 C, D) cho thấy ở các chủng BL21 có mang gene E7 HPV 6 và E7 HPV 11 được cảm ứng (giếng 5) có sự xuất hiện với mức biểu hiện vượt trội của một protein không thấy ở các mẫu mang vector không tái tổ hợp hoặc mang vector tái tổ hợp nhưng khơng được cảm ứng. Kích thước của protein trong hai trường hợp phù hợp với kết quả dự đốn lý thuyết là 16 kDa.
Hình 15. Kết quả SDS-PAGE (A) và Western blot (B) từ các vector pET-E7/6 (1), pET-E7/11 (2), Giếng 1: Thang phân tử lượng protein. Giếng 2,3: Protein tổng số từ E. coli BL21 (DE3) mang các vector nguyên thủy không được và được cảm ứng. Giếng 4,5: Protein tổng từ E. coli
BL21 (DE3) mang các vector tái tổ hợp không được và được cảm ứng. Giếng 6,7: phân đoạn protein thể vùi và thể tan từ chủng BL21mang các vector tái tổ hợp được cảm ứng.
C1 D1
A1
4 7 6 5 1 2 3 4 7 6 5 1 2 3
3 2 1 5 6 7 4 3 2 1 5 6 7 4
40
4.1.3.4. Kết quả biểu hiện protein L1 HPV 16 và L1 HPV 18
Kết quả điện di SDS-PAGE (hình 16 A) cho thấy khơng có sự hiện diện bất cứ vạch protein biểu hiện vượt mức nào, ngay cả trong điều kiện cảm ứng, ở chủng tái tổ hợp L1 HPV 16 (55 kDa). Còn ở chủng tái tổ hợp L1 HPV 18, trong điều kiện cảm ứng, có sự xuất hiện một vạch protein biểu hiện vượt mức với kích thước khoảng 40 kDa, ngắn hơn kích thước dự đốn khoảng 10 kDa (hình 16 B).
Kết quả Western Blot (hình 16 C) trên chủng tái tổ hợp L1 HPV 16 không thấy bất cứ tín hiệu nào. Cịn ở chủng tái tổ hợp L1 HPV 18, kháng thể kháng His cho tín hiệu dương tính với vạch kích thước 40 kDa phù hợp với kết quả SDS-PAGE. Tuy nhiên, do khơng có kháng thể đặc hiệu nên khơng thể kết luận về bản chất của protein này.
Hình 16. Kết quả SDS-PAGE (A, B) và Western blot (C, D) từ các vector pET-L1/16 (A, C) và pET-L1/18 (B, D).Giếng 1: Thang phân tử lượng protein. Giếng 2,3: Protein tổng số từ E. coli BL21 (DE3) không tái tổ hợp, không được và được cảm ứng. Giếng 4,5: Protein tổng từ E. coli BL21 (DE3) tái tổ hợp, không được và được cảm ứng. Giếng 6,7: phân đoạn protein thể vùi và
thể tan từ chủng BL21 tái tổ hợp được cảm ứng.
4.1.4. THU NHẬN VÀ TINH SẠCH PROTEIN TÁI TỔ HỢP
Các vector pET-E7, pET-p16, pET-E7/6, pET-E7/11 được biểu hiện và protein tái tổ hợp được thu nhận ở quy mô 1 l môi trường nuôi cấy cho mỗi lần nuôi.
Kết quả điện di SDS-PAGE (hình 18) và phân tích hàm lượng protein bằng phần mềm Total Lab Quant cho thấy các protein mục tiêu thu được có độ tinh sạch lớn hơn 90 % (phụ lục 38). Hàm lượng protein mục tiêu được xác định bằng phương pháp Bradford (phụ lục 3) cho thấy mức thu nhận trung bình khoảng 1-1,2 mg/l môi trường nuôi cấy. Tổng lượng sản xuất của mỗi protein là 10-14 mg.
41
Hình 17. Kết quả SDS-PAGE với protein p16INK4A(A), E7 HPV 16 (B) E7 HPV 6 (C), E7 HPV
11 (11) trước và sau tinh sạch. Giếng 1: Thang phân tử lượng protein;giếng 2: Protein đã tinh sạch;giếng 3: Protein tổng số từ chủng BL21 mang vector tái tổ hợp được cảm ứng;giếng 4,5:
Protein ở thể tan (4) và thể vùi (5) từ chủng BL21 mang vector tái tổ hợp được cảm ứng
Các protein tái tổ hợp này được sử dụng làm kháng nguyên gây đáp ứng miễn dịch chuột để tạo KTĐD và để kiểm tra KTĐD trong thử nghiệm ELISA.
4.2. KHẢO SÁT MỘT SỐ THƠNG SỐ CHO QUY TRÌNH THU NHẬN PROTEIN TÁI TỔ HỢP TINH SẠCH TÁI TỔ HỢP TINH SẠCH
Chúng tôi khảo sát một số thông số, xác định giá trị tối ưu cho các thơng số này và dựa vào đó để xây dựng quy trình tạo protein tái tổ hợp.
4.2.1. BIỂU HIỆN VÀ THU NHẬN PROTEIN TÁI TỔ HỢP
Các thông số khảo sát bao gồm : hệ vector biểu hiện, nhiệt độ cảm ứng, thời gian cảm ứng và nồng độ IPTG cảm ứng. Đây là những thông số quan trọng cho sản xuất protein tái tổ hợp (Chambers & Swalley, 2009).
4.2.1.1. Hệ vector biểu hiện
Điều kiện cảm ứng ở đây là : IPTG 0,5 mM, 6 giờ, 37°C. Các kết quả SDS-PAGE và Western blot (hình 14) cho thấy có sự chênh lệch về hàm lượng protein mục tiêu ở pha tan ở các hệ vector khác nhau. Bằng phần mềm Total Lab Quant chúng tơi tính tỉ lệ hai
protein mục tiêu E7 HPV 16 và p16INK4A ở pha tan trên protein mục tiêu tổng đồng thời
xác định tỉ lệ protein mục tiêu ở pha tan với các protein khác trong dịch ly giải tế bào.
B
1 2 3 4 5
A
42
Kết quả (bảng 10) so sánh mức độ biểu hiện protein mục tiêu so với các protein khác trong tế bào cho thấy ba hệ vector pETM-44, pE-SUMO3 và pGAT đều biểu hiện tốt cả hai protein mục tiêu, vector pET-28a(+) cho mức độ biểu hiện protein thấp nhất.
Bảng 10. Mức độ biểu hiện protein ở pha tan của các hệ vector
pET-28a(+) pETM-44 pE-SUMO3 pGAT Tỉ lệ protein mục tiêu ở pha
tan / protein mục tiêu tổng số
E7 HPV16 17% 60% 50% 80%
p16INK4A 30% 28% 83% 16%
Tỉ lệ protein mục tiêu ở pha tan / protein khác
E7 HPV16 10% 40% 60% 20%
p16INK4A 5% 15% 35% 40%
Trong khi đó, tỉ lệ protein mục tiêu ở pha tan trên protein mục tiêu tổng số giữa các hệ vector cho thấy cả ba đuôi dung hợp SUMO, MBP, GST đều có tác dụng tăng cường tính tan của protein tái tổ hợp, tuy nhiên có một trường hợp ngoại lệ là đi GST
lại khơng có tác dụng tăng cường tính tan riêng đối với protein p16INK4A. Đi dung hợp
GST có tác dụng gia tăng cao nhất tính tan của protein E7 HPV16 (80 %) trong khi đi
dung hợp SUMO lại tăng cường tính tan của protein p16INK4A tốt nhất (83 %).Như nhiều
cơng trình trước đây đã cơng bố, khả năng biểu hiện ở dạng tan/tủa của protein tái tổ hợp được quyết định bởi hai yếu tố - bản chất của chính protein ấy và hệ vector sử dụng.
Như vậy, nếu dựa trên khả năng thu nhận protein tái tổ hợp ở dạng tan cao nhất, các vector pETM-44, pE-SUMO3 và pGAT nên được chọn, trong đó pE-SUMO3 có vẻ trội hơn các vector còn lại. Tuy nhiên, cả ba hệ vector này đều mang đi dung hợp có kích thước lớn, cần được cắt bỏ nếu có yêu cầu về kháng nguyên thuần chất. Điều này dẫn đến sự phụ thuộc lớn vào enzyme nhập khẩu (thời gian, chất lượng, giá cả) dùng trong việc loại bỏ đi. Do đó, nếu protein tái tổ hợp về bản chất đã có tính tan tốt thì việc sử dụng vector pET-28a(+) là phương án đơn giản, có hiệu quả kinh tế cao.
4.2.1.2. Nhiệt độ cảm ứng
Chúng tôi cảm ứng chủng BL21 (DE3) mang các plasmid pET-p16, pETM-p16,
pSUMO-p16, pGAT-p16 ở các nhiệt độ 25oC, 30oC, 37oC với 1 mM IPTG trong 1 giờ.
Để xác định nhiệt độ cảm ứng tối ưu cho các vector tái tổ hợp này, chúng tơi tính tỉ lệ protein mục tiêu/protein khác trong tế bào bằng phần mềm Total Lab Quant. Nhiệt độ
cảm ứng tối ưu là nhiệt độ mà ở đó lượng protein p16INK4A biểu hiện ở pha tan là cao
43
Dựa vào kết quả SDS-PAGE (hình 18) và phân tích với phần mềm Total Lab Quant (bảng 10), chúng tôi nhận thấy tỉ lệ protein mục tiêu ở pha tan đối với các vector
pETM-p16, pSUMO-p16, pGAT-p16 đạt giá trị cao nhất ở 30oC (15,8 %, 39,6 %, 12,7
%) trong khi giá trị cao nhất đối với vector pET-28-p16 đạt được ở 25oC (9 %).
Hình18. Kết quả SDS-PAGE với các vector pET-p16 (A), pETM-p16 (B), pSUMO-p16 (C), pGAT-p16 (D) ở các nhiệt độ cảm ứng khác nhau.Giếng 1: Protein tổng số của chủng BL21 tái
tổ hợp không được cảm ứng. Giếng 2: Thang phân tử lượng protein. Giếng 3,5,7: Protein ở pha
tan từ chủng BL21 tái tổ hợp được cảm ứng ở nhiệt độ 25oC, 37oC, 30oC. Giếng 4,6,8: Protein ở
pha thể vùi từ chủng BL21 tái tổ hợp được cảm ứng ở nhiệt độ 25oC, 37oC, 30oC
Bảng 11. Kết quả phân tích bằng phần mềm Total Lab Quant mức độ biểu hiện protein pha tan với các protein khác của tế bào trong các hệ vector ở các nhiệt độ cảm ứng khác nhau
Nhiệt độ cảm ứng 25 30oC oC 37oC
pET-p16 9% 4,1% 3,9%
pETM-p16 13,3% 15,8% 7,2%
pSUMO-p16 36,0% 39,6% 37,2%
pGAT-p16 7,25% 12,7% 10,7%
Như vậy, nhiệt độ cảm ứng để thu được lượng protein tái tổ hợp cao nhất ở pha tan
đối với pETM-p16, pSUMO-p16, pGAT-p16 là 30oC, còn đối với pET-p16 là 25oC.
4.2.1.3. Nồng độ IPTG cảm ứng
Chúng tôi cảm ứng chủng E.coli BL21 (DE3) tái tổ hợp với các nồng độ IPTG 0
mM, 0,25 mM, 0,5 mM, 1 mM trong 6 giờ, ở nhiệt độ tối ưu cho từng hệ vector nhằm xác định nồng độ IPTG cảm ứng tốt nhất cho từng hệ vector. Phổ nồng độ IPTG được chọn dựa trên cơng trình của Swalley và cộng sự (2006), trong khoảng từ 0,1 mM đến 1,0 mM.
A
D C
44
Nồng độ IPTG tối ưu là nồng độ thấp nhất mà vẫn đảm bảo lượng protein p16INK4A tái tổ
hợp biểu hiện ở thể tan cao nhất so với các protein khác trong dịch ly giải tế bào.
Dựa vào kết quả điện di SDS-PAGE (hình 19) và phân tích bằng phần mềm Total Lab Quant (bảng 12) chúng tôi nhận thấy: mức độ biểu hiện protein mục tiêu đạt giá trị cao nhất khi nồng độ IPTG cảm ứng là 0,25 mM đốivới vector pSUMO-p16, 0,5 mM đối với các vector pETM-p16, pET-p16 và 1mM đối với vector pGAT-p16.
Hình19. Kết quả SDS-PAGE từ dịch protein thu nhận với các vector pET-p16 (A), pETM-p16 (B), pSUMO-p16 (C), pGAT-p16 (D) ở các nồng độ IPTG khác nhau.Giếng 1: Thang phân tử
lượng protein;giếng 2, 4,6,8: Protein ở thể vùi từ chủng BL21 tái tổ hợp được cảm ứng ở các nồng độ IPTG 0mM, 0,25mM, 0,5 mM, 1,0mM;giếng 3,5,7,9: Protein ở thể tan từ chủng BL21 tái
tổ hợp được cảm ứng ở các nồng độ IPTG 0mM, 0,25mM, 0,5mM, 1,0mM.
Bảng12. Kết quả phân tích bằng phần mềm Total Lab Quant mức độ biểu hiện protein pha tan với protein khác của tế bào trong các hệ vector ở các nồng độ IPTG khác nhau.
Như vậy, nồng độ IPTG cảm ứng tối ưu với các pSUMO-p16 là 0,25 mM, pET- p16, pETM-p16, là 0,5mM, còn đối với vector pGAT-p16 là 1 mM.
4.2.1.4. Thời gian cảm ứng:
Nhằm xác định thời gian cảm ứng tối ưu cho từng hệ vector, chúng tôi tiến hành
cảm ứng chủng E.coli BL21 (DE3) tái tổ hợp ở 2 giờ, 4 giờ, 6 giờ, 20 giờ, trong điều kiện
Nồng độ IPTG 0,25 mM 0,5 mM 1,0 mM pET-p16 6,3% 8,8% 3,6% pETM-p16 14,05% 20,7% 16,1% pSUMO-p16 38% 38,7% 33,1% pGAT-p16 9,2% 9,3% 11,7% A D C B
45
nhiệt độ và nồng độ IPTG đã xác định ở trên cho từng hệ vector. Phổ thời gian được chọn dựa trên cơng trình của Swalley và cộng sự (2006), với thời gian khảo sát cảm ứng biểu hiện trong khoảng 3-18 giờ. Thời gian cảm ứng tối ưu sẽ là thời gian ngắn nhất cho hàm
lượng protein biểu hiện p16INK4A tái tổ hợp ở pha tan cao nhất so với protein khác trong
dịch ly giải tế bào.
Hình 20. Kết quả SDS-PAGE từ dịch protein thu nhận với các vector pET-p16 (A), pETM- p16 (B), pSUMO-p16 (C), pGAT-p16 (D) ở các thời gian cảm ứng khác nhau.Giếng 1: Protein
tổng số từ chủng BL21 tái tổ hợp không được cảm ứng. Giếng 2: Thang phân tử lượng protein. Giếng 3,5,7,9: Protein ở thể tan trong tế bào chất của chủng BL21 tái tổ hợp được cảm ứng trong thời gian 2, 4, 6, 20 giờ. Giếng 4,6,8,10: Protein ở thể vùi trong tế bào chất của chủng
BL21 tái tổ hợp được cảm ứng trong thời gian 2, 4, 6, 20 giờ.