PHẦN 4 KẾT QUẢ
4.1. TẠO PROTEIN TÁI TỔ HỢP E7HPV 6/11/16, L1 HPV16/18 VÀ p16INK4A
4.1.1.2. Thu nhận các gene cần tạo dòng
Chúng tôi tiến hành phản ứng PCR nhân bản các gene E7 HPV 6/11/16, L1 HPV
16/18 và p16INK4A từ bệnh phẩm đã được định týp và kiểm tra bằng giải trình tự. Để gắn
32
trình tự cắt giới hạn phù hợp. Enzyme sử dụng là Pfu polymerase nhằm đảm bảo tính
trung thực của phản ứng nhân bản. Sản phẩm PCR được phân tích bằng điện di trên gel agarose 1.5 %.
Kết quả điện di (hình 5, 6, 7, 8) cho thấy sản phẩm PCR tương ứng với từng gene có kích thước phù hợp với kích thước dự đốn (bảng 4).
Hình 5. Sản phẩm PCR từ các gene E7/HPV 11 (A), E7/HPV 6 (B),
Giếng 1: Chứng âm. Giếng 2: Thang kích thước DNA. Giếng 3: Sản phẩm PCR với mồi đặc hiệu
Hình 6. Sản phẩm PCR từ gene E7 HPV16 với các cặp mồi E7-Nde/E7-Sa (A); E7-Bsa/E7-Sal (B), E7-Nco/E7-Sal (C). Giếng 1: Thang kích thước DNA (1kb). Giếng 2: Chứng âm. Giếng 3:
Sản phẩm PCR thu nhận gene E7 HPV16
Hình 7. Sản phẩm PCR từ gene p16INK4A với cặp mồi p16-Nde/p16-sal (A); cặp mồi p16-
Bsa/p16-sal (B); p16-Nco/p16-sal (C). Giếng 1: Thang kích thước DNA. Giếng 2: Chứng âm.
Giếng 3: Sản phẩm PCR thu nhận gene p16INK4A từ tế bào HeLa
A B C A B C A 3 2 1 500b 250b 500b250b B 1 3 2
33
Hình 8. Sản phẩm PCR từ gene L1 HPV 16 (A) và L1 HPV 18 (B) với cặp mồi L1/18f-Eco/ L1/18r-Xho. Giếng 1: Thang kích thước DNA. Giếng 2: Chứng âm. Giếng 3: Sản phẩm PCR thu
nhận gene L1 HPV18 từ mẫu DNA tách chiết từ dịch phết cổ tử cung. .
Các sản phẩm PCR sau đó được tinh sạch và dịng hóa vào các vector phù hợp.
4.1.2. DỊNG HĨA GENE MỤC TIÊU VÀO VECTOR pET28a(+), pE-SUMO3, pETM-44, pGAT VÀ KIỂM TRA VECTOR TÁI TỔ HỢP BẰNG PCR VÀ GIẢI TRÌNH TỰ
Chúng tơi dịng hóa các gene E7 HPV 6, HPV 11, L1 HPV 16/18 trong vector pET-28a(+). Các gene mà protein được sử dụng cho các nội dung nghiên cứu tiếp theo là
E7 HPV 16 và p16INK4A thì được dịng hóa vào 4 hệ vector là pET-28a(+), pE-SUMO3,
pETM-44, pGAT. Việc sử dụng 4 hệ vector biểu hiện cho phép khảo sát khả năng sử dụng các vector này trong tạo dòng biểu hiện nhiều loại protein khác trong tương lai.
Ký hiệu các vector tái tổ hợp được trình bày trong bảng 5.
Bảng 5. Ký hiệu các vector tái tổ hợp
Vector/Gene E7 HPV 6 E7 HPV 11 E7 HPV 16 p16INK4A L1 HPV16 L1 HPV 18
pET-28a(+) pET-
E7/6
pET- E7/11
pET-E7 pET-p16 pET-L1/16 pET-L1/18
pE-SUMO3 pSUMO-E7 pSUMO-p16
pETM-44 pETM-E7 pETM-p16
pGAT pGAT-E7 pGAT-p16
Các hệ vector trên được chọn vì chúng mang một promoter mạnh (T7 promoter) và mỗi hệ vector có một số ưu điểm riêng được trình bày ở bảng 6.
34
Bảng 6. Đặc điểm của các hệ vector sử dụng dịng hóa gene E7 HPV16 và p16INK4A
Chúng tôi biến nạp các plasmid trên vào tế bào E.coli DH5α và sàng lọc các khuẩn
lạc tái tổ hợp bằng phương pháp PCR khuẩn lạc sử dụng cặp mồi T7 promoter-T7 terminator. Các khuẩn lạc có mang gene mục tiêu được ni, thu sinh khối để tách chiết plasmid. Plasmid tái tổ hợp được kiểm tra bằng PCR với cặp mồi đặc hiệu (bảng 5) và giải trình tự.
Kết quả PCR trên plasmid tái tổ hợp E7 HPV 6, E7 HPV 11 (hình 9), E7HPV 16
(hình 10), p16INK4A (hình 11) cho thấy sự hiện diện của các sản phẩm nhân bản có kích
thước như dự đốn (bảng 4). Đối với hai plasmid tái tổ hợp L1 HPV 16 và L1 HPV 18 sản phẩm PCR khơng đạt được kích thước như mong muốn.
Kết quả so sánh trình tự đoạn chèn từ các plasmid tái tổ hợp với các trình tự trên ngân hàng gene NCBI bằng BLAST (phụ lục 1) cho thấy các plasmid kiểm tra đều mang gene mong muốn. Kết quả sử dụng ClustalX (phụ lục 2) cho thấy ở tất cả các plasmid tái
tổ hợp, các gene E7 HPV 6/11/16 và p16INK4A đã được tạo dòng đồng khung với khung
dịch mã trên plasmid.
Hệ vector Enzyme giới hạn Đuôi dung hợp Ưu điểm pET-28a(+) NdeI và SalI 6xHis - Dễ tinh sạch
- Không cần loại đi dung hợp vì đi 6xHis có tính miễn dịch thấp
pGAT NcoI và SmaI 6xHis và GST - Tăng hiệu quả tinh sạch
- Dễ tạo dòng đồng khung nhờ vị trí nhận
biết của NcoI
pE-SUMO3 BsaI và SalI SUMO và 6xHis - Tăng mức độ biểu hiện
- Tăng tính tan của protein tái tổ hợp - Loại bỏ đuôi dung hợp dễ dàng và đặc hiệu
pETM-44 NcoI và SalI 6xHis và MBP - Tăng tính tan của protein tái tổ hợp - Dễ tạo dịng đồng khung nhờ vị trí nhận
biết của NcoI
- “Subcloning” được vào các vector cùng nhóm
35
A B C D
C D
B A
Kết quả BLAST trình tự đoạn chèn trong plasmid tái tổ hợp pET-L1/16 với các trình tự trên NCBI (phụ lục 2) cho thấy plasmid chỉ mang một phần của gene mã hóa L1 với kích thước khoảng 1176 bp, ngắn hơn kích thước dự đốn của L1 HPV 16 (1596 bp) do mất một đoạn 420 bp ở đầu 5’ của gene. Kết quả PCR trên plasmid (hình 12) khẳng định kết quả giải trình tự với kích thước sản phẩm nhân bản ngắn hơn khoảng 420 bp. Chúng tôi thu được kết quả tương tự với gene L1 HPV 18. Do bị mất một đoạn ở đầu 5’ nên không thể xác định được sự đồng khung của trình tự được gắn vào plasmid ; chúng tôi vẫn quyết định tiến hành cảm ứng biểu hiện trên hai plasmid tái tổ hợp này.
Hình 9. Sản phẩm PCR từ các plasmid tái tổ hợp mang gene E7 HPV11 (A) và E7 HPV6 (B);Giếng 1: Thang kích thước DNA . Giếng 2: Chứng âm. Giếng 3: chứng dương. Giếng 4: Sản
phẩm PCR từ plasmid tái tổ hợp.
Hình 10. Sản phẩm PCR từ các plasmid tái tổ hợp mang gene E7 HPV16: pET-E7 (A); pETM-E7(B); pSUMO-E7(C); pGAT-E7 (D).Giếng 1: Thang kích thước DNA . Giếng 2: Chứng pETM-E7(B); pSUMO-E7(C); pGAT-E7 (D).Giếng 1: Thang kích thước DNA . Giếng 2: Chứng
âm. Giếng 3: chứng dương. Giếng 4: Sản phẩm PCR từ plasmid tái tổ hợp.
\
Hình 11. Sản phẩm PCR từ các plasmid tái tổ hợp mang gene p16INK4A: pET-p16 (A);
pETM-p16(B; pSUMO-p16(C); pGAT-p16 (D).Giếng 1: Thang kích thước DNA (1kb). Giếng 2:Chứng âm. Giếng 3: Chứng dương. Giếng 4: Sản phẩm PCR từ plasmid tái tổ hợp.
B 1 2 3 4 500bp 250bp A 2 3 4 1 500bp 250bp
36
Hình 12. Sản phẩm PCR từ các plasmid tái tổ hợp mang gene L1 HPV16 (A) và L1 HPV 18(B). Giếng 1: Thang kích thước DNA (1kb). Giếng 2: Chứng âm. Giếng 3: Chứng dương. Giếng 4, 5, 6: Sản phẩm PCR từ plasmid tái tổ hợp lần lượt với các cặp mồi: mồi xuôi đặc hiệu- mồi ngược đặc hiệu, mồi xuôi đặc hiệu-mồi T7 terminator, mồi T7 promoter-mồi ngược đặc hiệu.
4.1.3. BIỂU HIỆN PROTEIN TÁI TỔ HỢP VÀ KIỂM TRA CHÚNG BẰNG SDS- PAGE VÀ WESTERN BLOT
Chúng tôi biến nạp các plasmid tái tổ hợp vào chủng E.coli BL21 (DE3). Chủng
E.coli BL21 (DE3) mang các plasmid tái tổ hợp được cảm ứng ở 370C trong 6 giờ với 0,5mMIPTG. Kết quả biểu hiện protein tái tổ hợp được kiểm tra bằng phương pháp điện di SDS-PAGE và Western blot với KTĐD kháng protein E7 HPV 16 (hình 13) và p16INK4A (hình 14).
4.1.3.1 Kết quả biểu hiện protein E7 HPV 16
Kết quả điện di SDS-PAGE (hình 13 A1,2,3,4) cho thấy ở chủng BL21 mang các vector tái tổ hợp được cảm ứng (giếng 5) có sự xuất hiện với mức biểu hiện vượt trội của một protein không thấy ở các mẫu mang vector không tái tổ hợp hoặc mang vector tái tổ hợp nhưng không được cảm ứng.
Các protein mục tiêu có kích thước lớn hơn dự đoán đối với protein E7 HPV 16 biểu hiện ở dạng dung hợp với các đi khác nhau theo tính tốn lý thuyết (bảng 7).
Bảng 7. Phân tử lượng dự đốn của protein E7 HPV16 dung hợp với các đi khác nhau.
Hệ vector Dạng dung hợp của protein
E7 HPV16
Kích thước dự đốn
Kích thước trên gel polyacrylamide 12%
pET-28a(+) 6xHis-E7 14 kDa 20 kDa
pETM-44 6xHis-protein MBP-E7 51 kDa 57 kDa
pE-SUMO3 6xHis- protein SUMO –E7 30 kDa 36 kDa
37 A1 B1 A2 B2 A3 B3 B4 A4
Hình 13. Kết quả SDS-PAGE (A ) và Western blot (B) từ các vector pET-E7 (1), pETM-E7 (2), pSUMO-E7 (3), pGAT-E7 (4). Giếng 1: Thang phân tử lượng protein. Giếng 2,3: Protein tổng
của E.coli BL21 (DE3) mang các vector nguyên thủy không được và được cảm ứng.Giếng 4,5: Protein tổng từ E.coli BL21 (DE3) mang các vector tái tổ hợp không được và được cảm ứng: Giếng 6,7: phân đoạn protein thể vùi và thể tan từ chủng BL21mang các vector tái tổ hợp được
cảm ứng.
Sự khác biệt này đã được Moro và cộng sự (1996) ghi nhận. Cơng trình này cho thấy sự di chuyển của một polypeptide trong gel polyacrylamide phụ thuộc vào tương tác giữa nó với các phân tử SDS. Sự hiện diện của các amino acid giàu điện tích âm trong chuỗi polypetide sẽ cản trở tương tác này. Đặc biệt, sự hiện diện của hai amino acid tích điện âm, glutamic acid hay aspartic acid, liền kề nhau sẽ hạn chế sự liên kết giữa SDS và chuỗi polypeptide khiến chuỗi polypeptide di chuyển chậm trong gel. Protein E7 HPV 16 có thành phần glutamic và aspartic acid lần lượt là 9,18 % và 10,2 % và có một vùng, từ amino acid thứ 33 đến amino acid thứ 37, giàu glutamic và aspartic acid. Mặt khác, protein E7 HPV16 cịn có proline với tỉ lệ 6,12 % có khả năng tăng tính bền của cấu trúc protein khiến cho protein càng khó hình thành phức hợp với phân tử SDS.
Kết quả Western blot (hình 13 B1,2,3,4) với kháng thể đặc hiệu cho protein E7 HPV16 cho thấy có vạch tín hiệu lai tương ứng với kết quả điện di SDS-PAGE.
38
4.1.3.2. Kết quả biểu hiện protein p16INK4A
Kết quả phân tích bằng phương pháp SDS-PAGE (hình 14 A1,2,3,4) cho thấy ở
chủng vi khuẩn tái tổ hợp mang gene p16INK4A được cảm ứng (giếng 5) xuất hiện một
vạch protein không thấy ở những mẫu không được cảm ứng hoặc không mang vector tái
tổ hợp. Tín hiệu này phù hợp với kích thước dự đoán của protein p16INK4A ở trạng thái
dung hợp với các đi khác nhau được trình bày ở bảng 8.
Kết quả Western blot (hình 14 B1,2,3,4) với kháng thể kháng p16INK4A trên các
vector tái tổ hợp với KTĐD đặc hiệu cho p16INK4A đều cho tín hiệu lai ở vị trí tương ứng
với phân tử lượng của protein p16INK4A ở dạng dung hợp với các đi khác nhau.
Hình 14. Kết quả SDS-PAGE (A) và Western blot (B) từ các vector pET-p16 (1), pETM-p16 (2), pSUMO-p16 (3), pGAT-p16 (4). Giếng 1: Thang phân tử lượng protein. Giếng 2,3: Protein tổng số từ E.coli BL21 (DE3) mang các vector nguyên thủy không được và được cảm ứng.Giếng 4,5: Protein tổng từ E.coli BL21 (DE3) mang các vector tái tổ hợp không được và được cảm ứng.
Giếng 6,7: phân đoạn protein thể vùi và thể tan từ chủng BL21mang các vector tái tổ hợp được cảm ứng.
A1 B1
A2 B2
A3 B3
39
Bảng 8. Kích thước dự đốn của protein p16INK4A ở dạng dung hợp với các đuôi khác nhau
Hệ vector Trạng thái dung hợp của protein p16INK4A Kích thước dự đốn
pET28a(+) 6xHis-p16INK4A 18,7 kDa
pETM44 6xHis-protein MBP-p16INK4A 57 kDa
pSUMO3 6xHis- protein SUMO -p16INK4A 34 kDa
pGAT 6xHis- protein GST -p16INK4A 43 kDa
Kết quả SDS-PAGE và Western blot (hình 14) cho thấy chúng tôi đã biểu hiện
thành công protein E7 HPV16 và p16INK4A tái tổ hợp ở dạng dung hợp với các đuôi 6xHis
(pET28a(+)), 6xHis-MBP (pETM-44), 6xHis-SUMO (pSUMO3), 6xHis-GST (pGAT).
4.1.3.3. Kết quả biểu hiện protein E7 HPV 6 và E7 HPV 11
Kết quả điện di SDS-PAGE và Western blot với kháng thể kháng His (đối với E7 HPV 6) (hình 15 A, B) và kháng thể đặc hiệu (E7 HPV 11) (hình 15 C, D) cho thấy ở các chủng BL21 có mang gene E7 HPV 6 và E7 HPV 11 được cảm ứng (giếng 5) có sự xuất hiện với mức biểu hiện vượt trội của một protein không thấy ở các mẫu mang vector không tái tổ hợp hoặc mang vector tái tổ hợp nhưng khơng được cảm ứng. Kích thước của protein trong hai trường hợp phù hợp với kết quả dự đoán lý thuyết là 16 kDa.
Hình 15. Kết quả SDS-PAGE (A) và Western blot (B) từ các vector pET-E7/6 (1), pET-E7/11 (2), Giếng 1: Thang phân tử lượng protein. Giếng 2,3: Protein tổng số từ E. coli BL21 (DE3) mang các vector nguyên thủy không được và được cảm ứng. Giếng 4,5: Protein tổng từ E. coli
BL21 (DE3) mang các vector tái tổ hợp không được và được cảm ứng. Giếng 6,7: phân đoạn protein thể vùi và thể tan từ chủng BL21mang các vector tái tổ hợp được cảm ứng.
C1 D1
A1
4 7 6 5 1 2 3 4 7 6 5 1 2 3
3 2 1 5 6 7 4 3 2 1 5 6 7 4
40
4.1.3.4. Kết quả biểu hiện protein L1 HPV 16 và L1 HPV 18
Kết quả điện di SDS-PAGE (hình 16 A) cho thấy khơng có sự hiện diện bất cứ vạch protein biểu hiện vượt mức nào, ngay cả trong điều kiện cảm ứng, ở chủng tái tổ hợp L1 HPV 16 (55 kDa). Còn ở chủng tái tổ hợp L1 HPV 18, trong điều kiện cảm ứng, có sự xuất hiện một vạch protein biểu hiện vượt mức với kích thước khoảng 40 kDa, ngắn hơn kích thước dự đốn khoảng 10 kDa (hình 16 B).
Kết quả Western Blot (hình 16 C) trên chủng tái tổ hợp L1 HPV 16 khơng thấy bất cứ tín hiệu nào. Còn ở chủng tái tổ hợp L1 HPV 18, kháng thể kháng His cho tín hiệu dương tính với vạch kích thước 40 kDa phù hợp với kết quả SDS-PAGE. Tuy nhiên, do khơng có kháng thể đặc hiệu nên khơng thể kết luận về bản chất của protein này.
Hình 16. Kết quả SDS-PAGE (A, B) và Western blot (C, D) từ các vector pET-L1/16 (A, C) và pET-L1/18 (B, D).Giếng 1: Thang phân tử lượng protein. Giếng 2,3: Protein tổng số từ E. coli BL21 (DE3) không tái tổ hợp, không được và được cảm ứng. Giếng 4,5: Protein tổng từ E. coli BL21 (DE3) tái tổ hợp, không được và được cảm ứng. Giếng 6,7: phân đoạn protein thể vùi và
thể tan từ chủng BL21 tái tổ hợp được cảm ứng.
4.1.4. THU NHẬN VÀ TINH SẠCH PROTEIN TÁI TỔ HỢP
Các vector pET-E7, pET-p16, pET-E7/6, pET-E7/11 được biểu hiện và protein tái tổ hợp được thu nhận ở quy mô 1 l môi trường nuôi cấy cho mỗi lần ni.
Kết quả điện di SDS-PAGE (hình 18) và phân tích hàm lượng protein bằng phần mềm Total Lab Quant cho thấy các protein mục tiêu thu được có độ tinh sạch lớn hơn 90 % (phụ lục 38). Hàm lượng protein mục tiêu được xác định bằng phương pháp Bradford (phụ lục 3) cho thấy mức thu nhận trung bình khoảng 1-1,2 mg/l môi trường nuôi cấy. Tổng lượng sản xuất của mỗi protein là 10-14 mg.
41
Hình 17. Kết quả SDS-PAGE với protein p16INK4A(A), E7 HPV 16 (B) E7 HPV 6 (C), E7 HPV
11 (11) trước và sau tinh sạch. Giếng 1: Thang phân tử lượng protein;giếng 2: Protein đã tinh sạch;giếng 3: Protein tổng số từ chủng BL21 mang vector tái tổ hợp được cảm ứng;giếng 4,5:
Protein ở thể tan (4) và thể vùi (5) từ chủng BL21 mang vector tái tổ hợp được cảm ứng
Các protein tái tổ hợp này được sử dụng làm kháng nguyên gây đáp ứng miễn dịch chuột để tạo KTĐD và để kiểm tra KTĐD trong thử nghiệm ELISA.
4.2. KHẢO SÁT MỘT SỐ THƠNG SỐ CHO QUY TRÌNH THU NHẬN PROTEIN TÁI TỔ HỢP TINH SẠCH TÁI TỔ HỢP TINH SẠCH
Chúng tôi khảo sát một số thông số, xác định giá trị tối ưu cho các thông số này và dựa vào đó để xây dựng quy trình tạo protein tái tổ hợp.
4.2.1. BIỂU HIỆN VÀ THU NHẬN PROTEIN TÁI TỔ HỢP
Các thông số khảo sát bao gồm : hệ vector biểu hiện, nhiệt độ cảm ứng, thời gian cảm ứng và nồng độ IPTG cảm ứng. Đây là những thông số quan trọng cho sản xuất protein tái tổ hợp (Chambers & Swalley, 2009).
4.2.1.1. Hệ vector biểu hiện
Điều kiện cảm ứng ở đây là : IPTG 0,5 mM, 6 giờ, 37°C. Các kết quả SDS-PAGE và Western blot (hình 14) cho thấy có sự chênh lệch về hàm lượng protein mục tiêu ở pha tan ở các hệ vector khác nhau. Bằng phần mềm Total Lab Quant chúng tơi tính tỉ lệ hai
protein mục tiêu E7 HPV 16 và p16INK4A ở pha tan trên protein mục tiêu tổng đồng thời
xác định tỉ lệ protein mục tiêu ở pha tan với các protein khác trong dịch ly giải tế bào.
B
1 2 3 4 5
A
42
Kết quả (bảng 10) so sánh mức độ biểu hiện protein mục tiêu so với các protein khác trong tế bào cho thấy ba hệ vector pETM-44, pE-SUMO3 và pGAT đều biểu hiện tốt cả hai protein mục tiêu, vector pET-28a(+) cho mức độ biểu hiện protein thấp nhất.
Bảng 10. Mức độ biểu hiện protein ở pha tan của các hệ vector
pET-28a(+) pETM-44 pE-SUMO3 pGAT Tỉ lệ protein mục tiêu ở pha
tan / protein mục tiêu tổng số
E7 HPV16 17% 60% 50% 80%
p16INK4A 30% 28% 83% 16%
Tỉ lệ protein mục tiêu ở pha tan / protein khác
E7 HPV16 10% 40% 60% 20%
p16INK4A 5% 15% 35% 40%
Trong khi đó, tỉ lệ protein mục tiêu ở pha tan trên protein mục tiêu tổng số giữa các hệ vector cho thấy cả ba đuôi dung hợp SUMO, MBP, GST đều có tác dụng tăng cường tính tan của protein tái tổ hợp, tuy nhiên có một trường hợp ngoại lệ là đi GST