PHẦN 4 KẾT QUẢ
4.4. KHẢO SÁT MỘT SỐ THƠNG SỐ CHO QUY TRÌNH TẠO KTĐD
4.4.1.2. Xác định một số điều kiện nuôi tếbào 4H5 để sản xuất KTĐD
Chúng tôi khảo sát hai thông số là mật độ tế bào cấy và nồng độ FBS trong mơi trường ni cấy vì : (1) sinh khối tế bào lai sử dụng để sản xuất càng lớn thì lượng kháng thể tạo ra càng nhiều (Oztuk & Palsson, 1990), mà mật độ tế bào cấy ban đầu có tác động lớn đến q trình tăng sinh tế bào ni, (2) tuy FBS chứa nhiều thành phần thiết yếu cho sự tăng trưởng tế bào lai nhưng bao hàm nhiều bất lợi như : có thành phần phức tạp với hàm lượng các chất có thể biến đổi theo lơ nên sẽ ảnh hưởng đến độ ổn định của quy trình ni, tăng chi phí sản xuất và cần thêm quá trình tinh sạch KTĐD sau sản xuất.
Mật độ tế bào cấy
Chúng tôi khảo sát hai mật độ tế bào cấy là 2 x 105 tế bào/ml (mật độ thấp) và 2 x
106 tế bào/ml (mật độ cao). Nồng độ FBS sử dụng là 10 %. Kết quả (hình 40) cho thấy
mật độ cấy cao (2 x 106 tế bào/ml) tạo ra nồng độ KTĐD cao hơn 8 lần so với mật độ cấy
64
Hình 40 . Tăng trưởng tế bào(A) và nồng độ KTĐD (B)thu được với mật độ cấy thấp và cao
Nồng độ FBS trong môi trường nuôi tế bào
Chúng tôi sử dụng mật độ tế bào cấy là 2 x 106 tế bào/ml và khảo sát hiệu quả sản
xuất KTĐD trong các môi trường nuôi cấy có nồng độ huyết thanh là 2 %, 5 %, 10 % FBS và môi trường khơng có huyết thanh (SFM). Mơi trường SFM có chứa các thành phần như transferrin và insulin thay thế huyết thanh giúp đảm bảo sự tăng trưởng của tế bào lai và tăng hiệu quả sản xuất KTĐD. Hiệu quả sản xuất KTĐD được đánh giá dựa trên nồng độ KTĐD trong môi trường nuôi cấy được xác định bằng phương pháp ELISA và thời gian cần để sản xuất KTĐD.
Hình 41. Sự thay đổi mật độ tế bào (A), tỉ lệ tế bào sống (B), nồng độ kháng thể (C) theo thời gian trong các mơi trường có nồng độ huyết thanh khác nhau và môi trường SFM.
Kết quả (hình 41A và B, phụ lục 12) cho thấy trong mơi trường có bổ sung 5 % FBS, mật độ và tỉ lệ tế bào sống được giữ ở mức ổn định trong 48 giờ. Ngồi ra, trong mơi trường này, hàm lượng KTĐD đạt giá trị tối đa là 71,9 µg/ml (hình 28C) sau 96 giờ sản xuất là giá trị nồng độ cao nhất, tương đương với môi trường bổ sung 10 % FBS. Trong mơi trường có bổ sung 2 % FBS và mơi trường SFM, mật độ và tỉ lệ tế bào sống giảm nhanh. Ngoài ra, nồng độ kháng thể tối đa đạt được thấp hơn so với mơi trường có bổ sung 5 % FBS.
65
Hình 42. Sự thay đổi mật độ tế bào và nồng độ kháng thể theo thời gian trong các mơi trường
có nồng độ huyết thanh khác nhau và môi trường SFM, với mật độ cấy thấp (2 x 105 tế
bào/ml) và cao (2 x 106 tế bào/ml)
Chúng tôi khẳng định kết quả khảo sát riêng từng thông số bằng cách khảo sát kết hợp đồng thời hai thông số – mật độ tế bào cấy và nồng độ FBS.
Kết quả (hình 42) cho thấy ở mật độ cấy cao và với 5 % hoặc 10 % FBS (hình 42 - G và H), nồng độ KTĐD tạo được là cao nhất. Mật độ cấy cao và môi trường chứa 2 % FBS (hình 42 F) hoặc SFM (hình 42 E) cho nồng độ KTĐD thấp hơn. Tuy nhiên, hiệu quả kinh tế khi sử dụng môi trường SFM khơng cao vì đắt gấp 3-5 lần mơi trường ni
66
bình thường. Bên cạnh đó, để sử dụng nồng độ FBS 2 %, tế bào cần được thích nghi trước bằng cách cấy chuyền trong những mơi trường có nồng độ FBS giảm dần; và điều này làm kéo dài thời gian và tăng cao chi phí tạo KTĐD.
Như vậy, với dịng tế bào lai 4H5, chúng tơi đã xác định điều kiện nuôi cấy và sản xuất KTĐD cho 2 giai đoạn :
Giai đoạn thu nhận sinh khối hybridoma để làm nguyên liệu cấy : nuôi cấy 48 giờ
trong mơi trường RPMI 1640 có bổ sung 10 % FBS
Giai đoạn sản xuất KTĐD từ hybridoma nuôi cấy : mật độ tế bào cấy là 2 x 106 tế
bào/ml, mơi trường RPMI 1640 có bổ sung 5 % FBS và thu mẫu sau 96 giờ.
4.4.2. QUY TRÌNH SẢN XT KTĐD QUA NI CẤY BIOREACTOR
Wave bioreactor là hệ thống ni cấy tế bào động có nhiều ưu điểm. Sự trộn đều mơi trường trong túi ni của bioreactor nhờ vào sóng (wave) do chuyển động lắc ngang (rocking motion) của hệ thống giúp phân phối thành phần dinh dưỡng, trao đổi oxy tốt hơn, hòa trộn đáy khơng để lắng và ít làm tổn hại đến tế bào (Singh, 1999).
Bước thu nhận sinh khối tế bào dùng để cấy tương tự như trong nuôi cấy tĩnh. Chúng tôi khảo sát các điều kiện cho giai đoạn nuôi hybridoma để sản xuất kháng thể.
Hai thông số cơ bản cần thiết cho sự tăng trưởng của hybridoma là mật độ tế bào cấy và nồng độ FBS cũng được khảo sát trong nội dung này. Các thông số khác như tốc độ lắc, góc lắc, tốc độ thơng khí, nhiệt độ được thiết lập theo khuyến cáo của nhà sản xuất và một số cơng trình đã cơng bố (Tang & cs, 2007).
4.4.2.1. Mật độ tế bào cấy
Theo khuyến cáo của nhà sản xuất, mật độ 5 x 105 tế bào/ml là mật độ cấy thấp
nhất khi sử dụng cho hệ thống Wave bioreactor. Do đó, chúng tơi khảo sát hai mật độ tế
bào cấy là 5 x 105 tế bào/ml và 1 x 106 tế bào/ml ở nồng độ FBS 5 % để đánh giá khả
năng tăng trưởng tế bào và sản xuất kháng thể theo thời gian. Kết quả (hình 43) cho thấy ở thời điểm 120 giờ, mật độ tế bào đạt mức cao nhất, còn nồng độ KTĐD vẫn tiếp tục tăng cho tới thời điểm 192 giờ, đạt mức khoảng 120 µg/ml ở cả hai mật độ cấy. Vì việc
chuẩn bị tế bào cấy để đạt mật độ 1 x 106 tế bào/ml cần nhiều thời gian và mơi trường hơn
nhưng khơng có sự khác biệt lớn so về nồng độ kháng thể tạo ra giữa hai mật độ cấynên
chúng tôi chọn sử dụng mật độ 5 x 105 tế bào/ml làm mật độ cấy cho hệ thống Wave
67
Hình 43 . Sự thay đổi mật độ tế bào, nồng độ kháng thể trong môi trường bổ sung 5%FBS khi
nuôi bằng bioreactor với mật độ cấy 5 x 105 tế bào/ml và 1 x 106 tế bào/ml.
4.4.2.2. Nồng độ FBS trong môi trường nuôi tế bào
Chúng tôi sử dụng mật độ tế bào cấy là 5 x 105 tế bào/ml để khảo sát tác động của
nồng độ FBS lên sự tăng trưởng của hybridoma và sự sản xuất KTĐD theo thời gian. Hai nồng độ FBS khảo sát là 5 % và 10 %.
Hình 44. Sự thay đổi mật độ tế bào, nồng độ kháng thể trong mơi trường có bổ sung 5 % FBS
(A) và 10 % FBS (B) khi nuôi bằng bioreactor với mật độ cấy 5 x 105 tế bào/ml.
Kết quả (hình 44, phụ lục 13) cho thấy, sau 48 giờ nuôi cấy, mật độ tế bào sống đạt
8,62 x 105 tế bào/ml trong môi trường bổ sung 5 % FBS và 11,56 x 105 trong môi trường
bổ sung 10 % FBS.Trong môi trường bổ sung 5 % FBS mật độ tế bào đạt mức tối đa ở thời điểm 120 giờ nhưng hàm lượng KTĐD vẫn tiếp tục tăng tới thời điểm 192 giờ (Hình 44-A), đạt khoảng 120 µg/ml và chưa có khuynh hướng giảm.Cịn trong mơi trường bổ sung 10 % FBS, hybridoma tăng trưởng nhanh, đạt mức tối đa ở thời điểm 96 giờ, hàm lượng KTĐD tăng đạt mức cao nhất sau 168 giờ ni cấy là khoảng 160 µg/ml rồi giảm dần (Hình 44-B). Theo kết quả này, lượng kháng thể thu được từ mơi trường ni có bổ
68
sung 10 % FBS cao hơn so với trong môi trường 5 % FBS. Do đó, chúng tơi chọn sử dụng môi trường bổ sung 10 % FBS với thời điểm thu kháng thể là ở thời điểm 168 giờ.
Như vậy, đối với dòng tế bào lai 4H5 nuôi cấy trong hệ thống Wave bioreactor,
các thông số xác định được là : mật độ cấy 5 x 105 tế bào/ml, môi trường RPMI 1640 bổ
sung 10% FBS và thu nhận kháng thể sau 168 giờ.
So sánh giữa nuôi cấy tĩnh và nuôi trong bioreactor, kết quả cho thấy nồng độ KTĐD đạt được trong nuôi cấy động cao gấp hai lần. Tính về hiệu quả kinh tế thì đầu tư ban đầu cho hệ thống bioreactor cao, nhưng nếu tính cho từng mẻ sản xuất thì ni cấy bioreactor có lợi hơn. Mặt khác, KTĐD sản xuất cũng đồng nhất hơn.
4.5. XÂY DỰNG QUY TRÌNH IMMUNOPCR
Phương pháp immunoPCR kêt hợp độ nhạy cao của PCR với khả năng phát hiện kháng ngun của ELISA. Có nhiều dạng immunoPCR (hình 45).
Phương pháp immunoPCR (hình 45a) chúng tơi sử dụng là kiểu “sandwich” gồm một kháng thể bắt giữ và một kháng thể phát hiện đánh dấu biotin, phức hợp này tương tác với streptavidin ; một trình tự DNA đánh dấu biotin cũng đồng thời tương tác với phân tử streptavidin này. Cuối cùng, trình tự DNA được nhân bản bằng PCR và sản phẩm nhân bản được phát hiện. Đây là quy trình đơn giản và dễ thực hiện nhất.
Hình 45. Các dạng immunoPCR và ELISA
69
Trước tiên, chúng tôi khảo sát một số thông số và từ những thơng số đã tối ưu hóa, chúng tơi xây dựng quy trình immunoPCR. Đối tượng nghiên cứu là protein E7 HPV 18.
Chúng tôi tạo hai phức hợp : KTĐD bắt giữ đánh dấu biotin và DNA đánh dấu biotin. Sau đó chúng tơi khảo sát nồng độ tối ưu của các thành phần sử dụng trong quy trình immunoPCR bao gồm : kháng thể phủ giếng, kháng thể bắt giữ đánh dấu biotin, streptavidin và DNA đánh dấu biotin.
4.5.1. TẠO KTĐD 4H5 ĐÁNH DẤU BIOTIN
Biotin và các dẫn xuất của nó có khả năng liên kết với nhóm amine và nhóm thiol của protein hoặc nhóm aldehyde của glycoprotein. Phương pháp đơn giản và phổ biến nhất để đánh dấu KTĐD là gắn n h ó m succinimidyl ester của biotin vào nhóm ε-amino của lysine trên kháng thể.
Chúng tơi biotin hóa kháng thể phát hiện 4H5 bằng NHS-D-Biotin (Sigma) với tỷ lệ 125 µl dung dịch biotin 1 mg/ml cho 1 mg KTĐD theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Sau đó, chúng tơi tiến hành đánh giá mức độ biotin hóa kháng thể (tức là tỷ lệ số mole phân tử biotin trên số mole phân tử kháng thể) bằng bộ kit HABA/Avidin (Sigma). Tỷ lệ
70
số mole biotin: số mole kháng thể thu được là 10, tức là trung bình trên 1 phân tử kháng thể có gắn khoảng 10 phân tử biotin, so với tỷ lệ đánh dấu trung bình là từ 3-8 phân tử biotin / phân tử kháng thể.
Ái lực của KTĐD 4H5-biotin với kháng nguyên mục tiêu E7 HPV18 được kiểm tra bằng phương pháp ELISA. Kết quả (hình 46, phụ lục 14) cho thấy hằng số ái lực của
4H5-biotin là 4,4±3x108(M-1).
Hình 46. Đồ thị hằng số ái lực của KTĐD 4H5-biotin với E7 HPV 18 tái tổ hợp
4.5.2. TẠO ĐOẠN DNA ĐÁNH DẤU BIOTIN
Đoạn DNA đánh dấu biotin, có kích thước 200 bp, được tạo ra bằng phản ứng PCR (hình 77) với mồi đánh dấu biotin ở đầu 5’. Sau khi tinh sạch, DNA-biotin (pha loãng 1/10) được cố định lên màng Hybond, lai với cộng hợp streptavidin-alkaline phosphatase. Tín hiệu lai được phát hiện thơng qua cơ chất hiện màu. Kết quả lai (hình 48) cho thấy đoạn DNA-biotin cho tín hiệu màu giống với giếng đối chứng, như vậy chúng tôi đã tạo được DNA đánh dấu biotin.
0.000 1.000 2.000 3.000 4.000 -4.176 -4.778 -5.380 -5.982 -6.584 -7.186 O D 4 0 5 n m
Gia tri logarit nong do khang the 4H5-biotin
1.25 µg/ml E7HPV18 0.625 µg/ml E7HPV18 0.3125 µg/ml E7HPV18 0.15 µg/ml HPV18
Hình47. PCR tạo DNA đánh dấu biotin. Giếng 1: thang dấu biotin. Giếng 1: thang DNA 100bp, giếng 2: DNA- biotin, giếng 3: chứng âm
Hình 48. Kết quả kiểm tra sự biotin hóa DNA bằng streptavidin cộng hợp alkaline phosphatase
71
4.5.3. KHẢO SÁT NỒNG ĐỘ KHÁNG THỂ 1D5 PHỦ GIẾNG
Do tính tương đồng cao giữa quy trình ELISA và immunoPCR, chúng tôi tiến hành tối ưu hóa nồng độ kháng thể bắt giữ và kháng thể phát hiện bằng ELISA sử dụng cộng hợp streptavidin-alkaline phosphatase (STV-AP). Chúng tôi sử dụng phương pháp checkerboard, cố định nồng độ kháng thể 4H5-biotin (10 µg/ml) và STV-AP, thay đổi nồng độ kháng thể 1D5 (hàng) và kháng nguyên E7 (cột).
Nồng độ kháng thể phủ giếng thường nằm trong khoảng từ 0,5 - 20 µg/ml nên chúng tơi sử dụng nồng độ kháng thể phủ giếng trong khoảng 40 – 0,391 µg/ml (đây là các nồng độ pha loãng bậc hai theo hàng dọc theo phương pháp checkerboard), để tìm nồng độ kháng thể bão hòa, tức là nồng độ tối thiểu kháng thể phủ giếng cho giá trị OD cao nhất. Chúng tôi khảo sát nồng độ bão hòa của kháng thể đa dòng ở năm nồng độ kháng ngun E7 pha lỗng bậc hai từ 5 µg/ml.
Kết quả từ đồ thị (hình 49, phụ lục 15) cho thấy điểm bão hòa kháng thể xuất hiện ở nồng độ 20 µg/ml. Như vậy, nồng độ kháng thể 1D5 phủ giếng tối ưu trong thử nghiệm ELISA là 20 µg/ml. Nồng độ kháng thể này được chọn để khảo sát những thông số tiếp theo.
Hình 49. Đồ thị khảo sát nồng độ kháng thể 1D5 phủ giếng
4.5.4. KHẢO SÁT NỒNG ĐỘ KHÁNG THỂ 4H5-BIOTIN VÀ STREPTAVIDIN-ALKALINE PHOSPHATASE (STV-AP) ALKALINE PHOSPHATASE (STV-AP)
Cố định nồng độ kháng thể 1D5 phủ giếng là 20 µg/ml, nồng độ kháng ngun E7 là 2,5 µg/ml, chúng tơi thay đổi nồng độ kháng thểphát hiện 4H5 theo hàng và STV-AP theo cột theo phương pháp checkerboard để tìm nồng độ bão hòa của chúng.
-0.50 0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 40 20 10 5 2.5 1.25 0.625 0 O D A 4 0 5 Nồng độ kháng thể 1D5 phủ giếng (µg/ml) 5 µg/ml 2,5 µg/ml 1,25 µg/ml 0,625 µg/ml 0,375 µg/ml
72
Nồng độ kháng thể phát hiện sử dụng thường nằm trong khoảng 0,5 – 4,0 µg/ml. Do vậy, chúng tơi chọn khảo sát phổ nồng độ kháng thể là 20 – 0,375 µg/ml, pha lỗng bậc hai theo hàng từ nồng độ 20 µg/ml tới nồng độ 0,375 µg/ml. STV-AP sử dụng ở 5 độ pha loãng 1/1000, 1/2000 và 1/4000, 1/8000, 1/16000 được pha từ nồng độ gốc của nhà sản xuất. Giếng khơng có 4H5 (giếng blank cho kháng thể phát hiện) và giếng khơng có STV-AP (giếng blank cho kháng thể thứ cấp) được dùng làm chứng.
Hình 50. Đồ thị khảo sát nồng độ kháng thể 4H5-biotin
Hình 51. Đồ thị khảo sát nồng độ STV-AP
Kết quả cho thấy điểm bão hòa xuất hiện ở 5 µg/ml kháng thể 4H5-biotin (hình 50, phụ lục 16). Nồng độ này được chọn là nồng độ kháng thể bắt giữ cho quy trình immunoPCR. Đối với STV-AP, chúng tôi thấy càng pha lỗng tín hiệu càng giảm dần (hình 51, phụ lục 17). Do đó, chúng tơi chọn độ pha lỗng 1/1000, cũng là độ pha loãng khuyến cáo của nhà sản xuất, để sử dụng cho các thí nghiệm ELISA so sánh sau này.
0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 1/1000 1/2000 1/4000 1/8000 1/16000 0 O D A 4 0 5 Nồng độ kháng thể 4H5 Biotin (µg/ml) 20 µg/ml 10 µg/ml 5 µg/ml 2,5 µg/ml 1,25 µg/ml 0.000 0.500 1.000 1.500 2.000 2.500 3.000 3.500 O D A 4 0 5 Nồng độ kháng thể 4H5 biotin (µg/ml) 1/1000 1/2000 1/4000 1/8000 1/16000
73
4.5.5. KHẢO SÁT NỒNG ĐỘ DNA ĐÁNH DẤU BIOTIN
Hình 52. Kết quả khảo sát nồng độ DNA đánh dấu biotin. 1-8: E7HPV18: 2.5 µg/ml, 1-7: DNA-biotin pha lỗng bậc 2 từ 100 pg/ml; 8: 0 pg/ml. 9-16: E7HPV18: 0 µg/ml; 9-15: DNA- DNA-biotin pha lỗng bậc 2 từ 100 pg/ml; 8: 0 pg/ml. 9-16: E7HPV18: 0 µg/ml; 9-15: DNA- biotin pha loãng bậc 2 từ 100 pg/ml; 16: 0 pg/ml; +: chứng dương; - : chứng âm (khơng có
DNA-biotin).
Nồng độ DNA-biotin đóng vai trò rất quan trọng trong q trình tối ưu hóa quy trình immunoPCR vì nó là thành phần chính tạo tín hiệu nền của phản ứng. Do đó, cần chọn được nồng độ DNA thích hợp đảm bảo độ nhạy của phản ứng đồng thời cho tín hiệu nền thấp nhất. Chúng tôi sử dụng các nồng độ kháng thể đã tối ưu, streptavidin 10 µg/ml và DNA-biotin có nồng độ giảm bậc 2 từ 100 pg/ml để xác định nồng độ DNA tối ưu.
Kết quả cho thấy ở 2 nồng độ 100 pg/ml (hình 52-9) và 50 pg/ml (hình 52-10) DNA-biotin tín hiệu nền ở các giếng khơng bổ sung kháng nguyên mục tiêu vẫn cao. Tín hiệu nền đó biến mất ở 25 pg/ml DNA (hình 52-11). Do đó, chúng tơi chọn 25 pg/ml DNA-biotin cho quy trình immunoPCR.
4.5.6. KHẢO SÁT NỒNG ĐỘ STREPTAVIDIN (STV)
Chúng tôi khảo sát nồng độ streptavidin nhằm giảm lượng streptavidin, là thành phần làm tăng chi phí của phản ứng, xuống mức tối thiểu mà vẫn duy trì được tín hiệu đặc