Plasmid Enzyme cắt giới hạn I Enzyme cắt giới hạn II
pET28(a) NdeI SalI
pE-SUMO3 BsaI SalI
pETM44 NcoI SalI
pEGFP-C2 HindIII SmaI
pGAT NcoI SmaI
Thiết lập phản ứng nối trong thể tích 10 µl : 1 µl buffer T4 DNA ligase 10X,
1µl plasmid đã xử lý enzyme cắt giới hạn với lượng khoảng 100-200 ng/phản ứng, một thể tích sản phẩm PCR đã xử lý enzyme sao cho đáp ứng tỉ lệ khối lượng giữa sản phẩm
19
PCR và plasmid bẳng 3:1 hay 1:1, 1 µl T4 DNA ligase (1 unit/µl), thêm H2O đã loại bỏ nuclease đủ 10 µl. Phản ứng nối được thực hiện ở 16°C qua đêm.
3.2.6.2. Biến nạp vector tái tổ hợp vào E. coli DH5α vàBL21 (DE3)
Chuyển tế bào E. coli DH5α từ ống nghiệm giữ giống vào ống nghiệm chứa 5 ml
môi trường LB. Nuôi cấy lắc qua đêm ở 37°C. Cấy 500 µl dịch ni cấy trên vào 50 ml môi trường LB, nuôi cấy lắc ở 37°C, 2 giờ đến khi đạt giá trị OD600 trong khoảng 0,3 – 0,6. Ly tâm thu sinh khối tế bào (5000 vòng/phút - 5 phút - 4°C). Hòa sinh khối trong 25 ml dung dịch CaCl2 100 mM lạnh. Ủ trên nước đá 30 phút. Ly tâm thu sinh khối tế bào (5000 vòng/phút - 5 phút - 4°C). Huyền phù nhẹ nhàng sinh khối tế bào khả nạp trong 1 ml dung dịch CaCl2 100 mM. Cho tồn bộ phản ứng nối vào 100 µl tế bào khả nạp. Ủ trên nước đá 30 phút. Gây sốc nhiệt ở 42°C - 90 giây. Chuyển vào khay đá, ủ trong 2 phút. Bổ sung 900 µl mơi trường LB và nuôi ủ trong 1 giờ. Ly tâm thu sinh khối (10.000 vòng/phút - 1 phút). Hòa sinh khối trong 50 µl LB và trải dịch huyền phù vi khuẩn trên đĩa LB thạch + kanamycin (30 µg/ml) hoặc ampicillin (100µg/ml). Ủ ở 37°C qua đêm.
3.2.6.3. Chọn lọc dịng vi khuẩn tái tổ hợp có mang gene mong muốn
Trước tiên, chúng tôi dùng phương pháp PCR trên khuẩn lạc với mồi chung để chọn lọc các dịng có mang gene mong muốn.
Phản ứng PCR được tiến hành trong 25 µl: một ít tế bào từ khuẩn lạc, 12,5 µl PCR mastermix 2X (Promega), 0,5 µl T7 promoter/terminator primer (25 µM). Chu kỳ nhiệt: 95°C - 5 phút, 1 chu kỳ ; 94°C – 30 giây, 50°C - 30 giây, 72°C - 2 phút, 40 chu kỳ ; 72°C - 6 phút, 1 chu kỳ.
Kết quả PCR được phân tích trên gel agarose 1 %.