PHẦN 1 TỔNG QUAN
1.2. Tổng quan về kháng thể đơn dòng
1.2.1. Sản xuất kháng thể đơn dòng bằng kỹ thuật tạo tế bào lai (hybridoma)
Kỹ thuật sản xuất KTĐD được đề xuất bởi hai nhà khoa học Cesar Milstein và Georges Köhler năm 1975. Kỹ thuật này dựa trên nguyên tắc lai tế bào u tủy (myeloma) với tế bào lympho B đã hoạt hóa. Tế bào u tủy là tế bào có khả năng phân chia vơ hạn
trong điều kiện nuôi cấy in vitro nhưng không tạo được kháng thể. Ngược lại, tế bào
lympho B có khả năng tổng hợp kháng thể nhưng sẽ chết sau một thời gian ni cấy vì là những tế bào tận cùng của q trình biệt hóa. Do đó, tế bào lai (hybridoma) sẽ kết hợp được ưu điểm phân chia vô hạn của tế bào u tủy và sản xuất kháng thể của tế bào B. KTDĐ là kháng thể thu nhận được từ một dòng tế bào lai đã được phân lập và tạo dòng (Ausubel, 2001).
KTĐD sản xuất từ kỹ thuật tạo tế bào lai đã được ứng dụng rộng rãi cho nghiên cứu và trở thành những cơng cụ chẩn đốn hiệu quả. Ngày nay, nhiều kỹ thuật mới đã ra đời nhằm tạo ra các KTĐD có khả năng dùng trong điều trị bệnh ở người.
4
1.2.2. Kỹ thuật sản xuất KTĐD từ người bằng cách bất tử hóa lympho bào
Khi xâm nhiễm vào lympho bào B, virus Epstein-Barr (EBV) sẽ làm bất tử hóa tế bào và tạo những dịng tế bào sản xuất kháng thể liên tục. EBV có thể làm bất tử cả những tế bào B ở trạng thái nghỉ do đó ưu điểm của phương pháp này là không cần gây đáp ứng miễn dịch tăng cường. Tuy nhiên phương pháp này có một số hạn chế như hiệu suất của q trình gây bất tử hóa rất thấp, các tế bào T được bất tử sẽ ức chế quá trình bất tử của tế bào B. Một số tác giả sử dụng phương pháp làm giàu số lượng các tế bào B đặc hiệu với kháng nguyên trước khi cho EBV xâm nhiễm nhằm tăng hiệu quả bất tử hoá. Một số tác giả khác dung hợp tế bào B đã bất tử với tế bào u tủy chuột hoặc tế bào u tủy lai giữa người và chuột nhằm tăng khả năng tăng trưởng và sản xuất kháng thể (Lanzavecchia & cs, 2007; Sugimoto & cs, 2004).
1.2.3. Dung hợp tế bào lympho người với tế bào u tủy chuột
Tế bào lympho người được thu nhận từ máu ngoại vi hoặc hạch lympho được dung hợp với tế bào u tủy chuột để tạo tế bào lai người-chuột. Tuy nhiên, phương pháp này gặp một số khó khăn về kỹ thuật như: hiệu quả dung hợp rất thấp và một số nhiễm sắc người bị mất ngẫu nhiên sau khi dung hợp (Karpas & cs, 2001).
1.2.4. Tạo kháng thể khảm và kháng thể “người hóa”
Bằng kỹ thuật di truyền người ta đã tạo ra DNA tái tổ hợp biểu hiện phân tử kháng thể khảm (chimeric antibody) và kháng thể “người hóa” (humanised antibody). Kháng thể khảm là kháng thể người có vùng biến đổi (Fv) của chuỗi nặng và chuỗi nhẹ từ KTĐD chuột đặc hiệu với kháng nguyên và có vùng hằng định (Fc) cuả kháng thể người. Kháng thể “người hóa” là kháng thể chỉ có 3 trình tự siêu biến đổi (CDR) trên phân tử kháng thể người có nguồn gốc từ chuột. DNA tái tổ hợp mã hóa cho các kháng thể khảm và kháng thể “người hóa” được chuyển vào tế bào động vật như tế bào u tủy không sản sinh các Ig và được cảm ứng biểu hiện vượt mức. Những dòng tế bào sản xuất kháng thể mục tiêu được chọn lọc và phân lập để thu nhận KTĐD. Kỹ thuật này có thể ứng dụng tạo kháng thể cho những kháng ngun có tính sinh miễn dịch thấp (Little & cs, 2009; Wu & cs, 2005).
Để làm giảm khả năng gây đáp ứng miễn dịch từ các kháng thể đơn dòng khảm và “người hóa”, các nhà nghiên cứu đã cố gắng xây dựng vài phương pháp tạo các KTĐD có nguồn gốc từ người, ví dụ như: phương pháp trình diện phage và phương pháp tạo chuột chuyển gene biểu hiện Ig người.
5
1.2.5. Phương pháp trình diện phage
Đối với phương pháp trình diện phage, một thư viện tổng hợp ngẫu nhiên các gene mã hóa cho chuỗi nặng và chuỗi nhẹ của Ig người được biểu hiện trên bề mặt cuả phage. Hỗn hợp phage này được cho tiếp xúc với phân tử kháng nguyên đích nhằm sàng lọc dịng phage có ái lực gắn tốt nhất với kháng nguyên. Phage mang gene mã hóa cho phân tử kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên được phân lập và làm giàu. Phương pháp này cho phép tạo KTĐD người phản ứng đặc hiệu với bất kỳ kháng nguyên nào. Sau nhiều lần sàng lọc sẽ thu được dòng phage mang gene mã hoá cho kháng thể có ái lực cao với kháng nguyên (Carmen & cs 2002).
1.2.6. Phương pháp tạo chuột chuyển gene biểu hiện Ig người
Trong phương pháp tạo chuột chuyển gene mã hóa Ig người, gene mã hóa cho chuỗi nặng và nhẹ cuả phân tử Ig chuột được làm bất hoạt hoàn toàn. Những chuột mang đột biến Ig–/– này được chuyển gene mã hóa cho IgH and Igκ của người. Như vậy, chuột chuyển gene khi được gây đáp ứng miễn dịch sẽ tạo kháng thể có chuỗi nặng và chuỗi nhẹ bắt nguồn từ người. Thực hiện phương pháp tạo bào lai cho phép thu nhận được KTĐD có nguồn gốc từ người (Davis & cs, 1999).
1.2.7. Sản xuất kháng thể đơn dòng
Phương pháp in vitro là phương pháp dựa vào khả năng sản xuất KTĐD của tế bào
lai trong môi trường nuôi cấy. Phương pháp này sử dụng các hệ thống nuôi cấy tế bào như các bình ni cấy và bioreactor cho phép tế bào phát triển và đạt mật độ cao.
Cách đơn giản nhất để sản xuất KTĐD in vitro là nuôi cấy hybridoma trong các
bình flask và tinh sạch kháng thể từ dịch nuôi cấy. Với phương pháp này, nồng độ kháng thể thấp chỉ khoảng 20 µg/ml. Một số phương pháp ni cấy dùng bình lắc (spinner flask và roller bottle) cho phép chất dinh dưỡng và khí hịa tan phân bố đều [Tarleton & cs, 1991]; ngoài ra cịn phương pháp ni trong các túi thấm khí giúp làm tăng nồng độ khí hịa tan, do đó làm gia tăng lượng kháng thể tạo thành. Tuy nhiên, phương pháp trên bị hạn chế khi ni các thể tích lớn hơn 1 lít vì các hệ thống khơng cung cấp đủ oxy cho tế bào. [Singh, 1999]
Các hệ thống nuôi cấy được sử dụng trong việc sản xuất lượng lớn kháng thể bao gồm nuôi cấy mẻ (fed-batch) và nuôi cấy liên tục (perfusion). Các hệ thống nuôi cấy mẻ đã trở nên rất thông dụng, quy mơ ni cấy có thể mở rộng lên tới 20000 lít. Trong ni cấy mẻ, các chất dinh dưỡng thiết yếu cho tế bào được bổ sung để duy trì nguồn dinh
6
dưỡng và các sản phẩm tạo ra trong q trình ni cấy sẽ được thu hoạch ở giai đoạn cuối của mẻ. Nhằm mục đích cải thiện sự tăng trưởng và sản xuất của tế bào, các hệ thống nuôi cấy liên tục làm tăng mật độ tế bào bằng cách bổ sung liên tục môi trường mới và loại bỏ nhanh các chất độc tích lũy trong môi trường nuôi, giúp tăng sản lượng và cải thiện chất lượng sản phẩm. [Voisard & cv, 2003]. Theo Deo & cs (1996) một hệ thống như vậy với thể tích 500 lít có thể ni cấy kéo dài tới 15 hay 35 ngày, sản xuất kháng thể lên đến hàng kilogram. Lượng kháng thể tạo ra trong hệ thống nuôi cấy liên tục cao hơn hệ thống nuôi cấy mẻ tới 10 lần, tuy nhiên bất tiện là cần thời gian kéo dài và máy móc phức tạp.
Ở quy mơ nhỏ hơn, hệ thống nuôi cấy liên tục sử dụng túi dùng một lần ngày càng nhiều. Hệ thống nuôi cấy như vậy, gọi là hệ thống Wave bioreactor, lượng oxy có thể lưu thơng tốt do hoạt động “wave” độc đáo, thể tích ni cấy có thể lên tới 100 lít trong khi
mật độ tế bào hơn 5 x 106 tế bào/mL. Đây là hệ thống lý tưởng để ni vài lít mơi trường
cho nhu cầu của phịng thí nghiệm. Như trước đây, cách duy nhất để sản xuất 5-100 lít tế bào ni cấy là sử dụng các bioreactor tốn kém. Wave bioreactor chỉ bằng 1/10 giá so với một bioreactor, dễ sử dụng, làm giảm nguy cơ nhiễm do không cần rửa túi hoặc khử trùng túi. Chỉ cần với một hệ thống kiểm soát CO2 và nhiệt độ theo mong muốn, các Wave bioreactor có thể sử dụng dễ dàng trong phịng thí nghiệm nhỏ, bệnh viện và các trường đại học... [Singh, 1999].
Tuy các phương pháp in vitro cho phép sản xuất một lượng lớn kháng thể nhưng một số dịng tế bào hybridoma khơng thích ứng tốt đối với các điều kiện ni cấy in vitro. Do đó, phương pháp in vivo được lựa chọn cho các trường hợp này. Phương pháp in vivo được
thực hiện bằng cách cấy ghép tế bào lai vào màng bụng của chuột sống và thu nhận dịch báng có chứa kháng thể từ khối u. Dịch báng này có nồng độ kháng thể lên đến 10 mg/ml, tuy nhiên phương pháp này bị hạn chế bởi những quy định về việc sử dụng động vật cho mục đích thí nghiệm [Committee on Methods of Producing Monoclonal Antibodies, 1999] .