PHẦN 1 TỔNG QUAN
1.3 Các phương pháp phát hiện E7 và p16INK4A
Các cơng trình nghiên cứu về tạo và ứng dụng KTĐD và đa dòng kháng E6, E7 HPV 16 và 18 cịn khá hạn chế. Sớm nhất có thể kể đến cơng trình tạo KTĐD trên chuột kháng protein E7 của HPV 16 của Tindle và cộng sự (1990). Cơng trình nghiên cứu
“Combination of anti-HPV 16 and 18 antibodies and uses thereof” của Zwerschke và
7
thương mại. Fiedler và cộng sự (2004) sử dụng kháng thể đa dòng thỏ kháng protein E7 HPV 16 đã được kiểm tra bằng Western blot và miễn dịch huỳnh quang trên các dòng CaSki, HeLa, U2-OS chuyển gene E7 HPV 16 để nghiên cứu mối liên quan giữa sự biểu hiện vượt mức protein E7 HPV 16 với sự giảm biểu hiện pRb trong sinh thiết cổ tử cung bằng phương pháp hóa mơ miễn dịch. Peck và cộng sự (2006) trong một thơng báo tóm tắt cho biết là đã phát triển được một strip test phát hiện protein E6 của HPV 16 dựa trên tương tác đặc hiệu của E6 với PDZ, phát hiện được 2,6 ng protein E6 tái tổ hợp. Một hướng phát triển khác tương tự nhưng ở dạng ELISA cũng trong thơng báo trên cho biết có thể giảm mức phát hiện tới 30 pg E6/thử nghiệm. Nhiều cơng trình phát triển KTĐD kháng E6 và E7 HPV 16, 18 và sử dụng chúng để phát hiện protein E6, E7 tái tổ hợp và trong dịch tế bào tử cung (Ehehalt & cs, 2011).
Trong chẩn đốn HPV, có rất nhiều kit phát hiện các type HPV “nguy cơ cao/thấp”nhưng chỉ kit Hybrid Capture II là đã được FDA (Food and Drug Administration) công nhận cho sử dụng vào chẩn đoán thường quy. Một kit khác đang được thử nghiệm rộng rãi tại Hoa kỳ, Canada, Nam Phi và được chính thức cho lưu hành tại Tây Ban Nha và Bồ Đào Nha là kit HPV OncoTect (Invirion Diagnostics). Kit này định lượng mRNA E6 và E7 trong tế bào biểu mô cổ tử cung dựa trên nguyên lý flow cytometry. Trong lĩnh vực miễn dịch học HPV, có nhiều kháng thể kháng protein E6 và E7 của HPV 16, 18 đã được thương mại hóa (Santa Cruz Biotechnology, Abcam, HyTest, Genway, AbD Serotec, Novus Biologicals, Lifespan Biosciences, Amynon Biotech), nhưng chủ yếu được ứng dụng trong nghiên cứu, chưa dùng cho chẩn đốn.
Nhiều cơng trình cho thấy việc sử dụng p16INK4A cho phép tăng hiệu quả của chẩn
đoán tế bào học cho các trường hợp tiền UTCTC. Protein p16INK4A trong chẩn đốn
“cervical intraepithelial neoplasia” có độ nhạy là 33%, độ đặc hiệu là 93%, giá trị tiên đoán dương là 93% và giá trị tiên đốn âm là 58% trong một cơng trình nghiên cứu trên 136 bệnh phẩm (Walts & cs, 2009). Một cơng trình khác tiến hành trên 232 mẫu Thin-
prep cho thấy trên nhóm ASCUS, độ đặc hiệu của chẩn đoán p16INK4A và HR-HPV DNA
PCR lần lượt là 42 % và 27 %. Điều này có nghĩa là 18 người (42 %) sẽ tránh được việc
theo dõi không cần thiết nếu sử dụng p16INK4A so với 6 người (27%) nếu sử dụng HR-
HPV DNA test (Schledermann & cs, 2008). Trong một cơng trình nghiên cứu diễn tiến
bệnh ở các trường hợp LSIL đi kèm với tăng cường biểu hiện p16INK4A cho thấy các bệnh
8
vậy việc can thiệp tức thì sẽ có ích lợi lớn cho các bệnh nhân này (Di Stefano & cs,
2010). Nhiều cơng trình cho thấy có mối tương quan giữa mức độ biểu hiện của p16INK4
và mức độ bất thường tế bào học (Norman & cs, 2007 ; Lee & cs, 2012). Một cơng trình tiến hành với sự tham gia của 12 nhà bệnh học đánh giá độc lập 500 mẫu mô cổ tử cung và so sánh với “chuẩn vàng” do 3 chuyên gia về bệnh học phụ khoa thiết lập. Kết quả cho
thấy việc bổ sung thêm xét nghiệm miễn dịch p16INK4A làm tăng khả năng phát hiện chính
xác và lặp lại các trường hợp CIN “high-grade” một cách có ý nghĩa thống kê, làm tăng độ nhạy lên 13%, giảm phân nửa các trường hợp âm tính giả (Klaes & cs, 2003 ;
Bergeron & cs, 2010). Nhìn chung, p16INK4A được xem là một chỉ thị hữu ích, bổ sung
cho xét nghiệm tế bào học, đặc biệt trong các trường hợp Pap không rõ ràng, giúp phát hiện các trường hợp CIN (Cervical Intraepithelial Neoplasia “high grade” từ các ca ASC- US (Atypical Squamous Cells of Undetermined Significance) và LSIL (Low Grade of Squamous Intraepithelial Lesion)(Schledermann & cs, 2008 ; Kurshumliu & cs, 2009).
Kit CINtec p16INK4A Cytology (mtm) có độ nhạy và độ đặc hiệu cao hơn thử nghiệm
Papillomavirus-nguy cơ cao (HR-HPV) trong việc phát hiện CIN “high-grade” trên những mẫu Pap thuộc nhóm ASC-US hay LSIL (Reuschenbach & cs, 2010 ; Denton & cs, 2010).
Phương pháp Immuno-PCR:
Đây là phương pháp tận dụng độ nhạy cao của PCR và tính linh hoạt của phương pháp ELISA để phát hiện một protein xác định, do Sano và cộng sự đề xuất năm 1992. Trong phương pháp này, kháng thể nhận biết đặc hiệu kháng nguyên được cộng hợp với một trình tự DNA dùng làm chỉ thị (marker). Trình tự DNA này được nhân bản bằng PCR và sản phẩm nhân bản sẽ được phát hiện bằng nhiều phương pháp. Kết quả là ngưỡng phát hiện của immuno PCR tăng lên 100 – 10.000 lần so với ELISA (Niemeyer, 2005 ; Malou &cs, 2011) (hình 1). ImmunoPCR được ứng dụng để phát hiện kháng nguyên với độ nhạy cao (Niemeyer &cs, 2007)
Phương pháp này bao gồm nhiều cách tiếp cận : (1) Kháng thể bắt giữ đặc hiệu kháng nguyên được cố định lên hạt nano hay lên giếng ELISA, kháng nguyên hiện diện trong mẫu sau khi được bắt giữ sẽ được phát hiện bằng kháng thể cộng hợp với một trình tự DNA ; (2) Cố định kháng nguyên trực tiếp lên giếng ELISA và phát hiện bằng kháng thể
9
cộng hợp với một trình tự DNA dùng để phát hiện trực tiếp kháng nguyên hiện diện trong lát cắt mô, tế bào (Adler& cs, 2008).
Hình 1. ELISA và immuno PCR. Nguyên lý (A) và độ nhạy (B) của hai phương pháp
Một số cơng trình trong nước về KTĐD có thể kể là : cơng trình tạo KTĐD INNNV ở tơm (Bùi Thị Bích Hằng & cs, 2008), đề tài “Nghiên cứu tạo bộ kit ELISA định lượng Alpha-fetoprotein (AFP) trong huyết thanh để hỗ trợ chẩn đoán bệnh ung thư tế bào gan (HCC) ở người” (Đỗ Thị Thảo, 2010-2011); đề tài “Nghiên cứu sản xuất và ứng dụng kháng thể đơn dịng trong chẩn đốn và điều trị bệnh ở người” (Lê Quang Huấn, 2012).