Mục tiêu dài hạn của đề tài là phát triển một công nghệ mới ở Việt Nam, công nghệ kháng thể đơn dịng (KTĐD) phục vụ cho chẩn đốn và điều trị. Đối tượng nghiên cứu của đề tài là HPV (Human Papillomavirus), một loại virus có liên quan chặt chẽ với ung thư cổ tử cung.
Mục tiêu cụ thể bao gồm :
1. Hồn chỉnh quy trình tạo KTĐD ở quy mơ nhỏ và vừa, áp dụng để tạo KTĐD kháng
một số protein liên quan đến ung thư cổ tử cung như E7 HPV16/18, p16INK4A.
2. Ứng dụng các KTĐD đã tạo được để phát triển các phương pháp chẩn đoán dựa trên kỹ thuật immuno PCR và miễn dịch mô/ tế bào.
3. Xây dựng một số kit nhằm phát hiện sớm ung thư cổ tử cung dựa trên kỹ thuật immuno-PCR và hóa miễn dịch mơ, tế bào.
10
PHẦN 3. VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP
3.1. VẬT LIỆU 3.1.1. Tế bào
Tế bào HeLa(ATCC- American Type Culture Collection), dòng tế bào ung thư cổ tử
cung có chứa bộ gene HPV 18, biểu hiện protein p16INK4A
Tế bào CaSki (ATCC), dịng tế bảo ung thư cổ tử cung có chứa bộ gene của HPV 16. Tế bào C-33 A (ATCC), dòng tế bào ung thư cổ tử cung không chứa bộ gene HPV. Tế bào MCF-7 (ATCC), dịng tế bào khơng biểu hiện protein p16INK4A
Tế bào u tủy P3X63Ag8.653 (ATCC) không sản sinh các chuỗi immunoglobin và mất
khả năng tổng hợp enzyme HGPRT (Hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase).
Dòng tế bào lai 1D5 và 4H5 sản xuất KTĐD kháng protein E7 HPV18 được tạo ra
trong hợp tác giữaPTN SHPT–ĐH KHTN–ĐHQGTpHCM với Trung tâm Nghiên cứu Y sinh học Cordeliers - Đơn vị INSERM 255 (Pháp) năm 2006.
Tế bào CHO–K1 được nhận từ Phịng thí nghiệm Tế bào gốc – ĐHQG HCM, nuôi cấy
và bảo quản tại PTN SHPT – ĐHKHTN – ĐHQG HCM.
Các dòng tế bào được ni cấy và bảo quản tại phịng thí nghiệm Sinh học phân tử (PTN SHPT) - bộ môn Di Truyền – khoa Sinh Học – trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên (ĐHKHTN) – ĐHQG HCM.
3.1.2. Chủng vi sinh vật
Chủng vi khuẩn dùng để dịng hố : E. coli (Escherichia coli) DH5 F–,
ø80dlacZΔM15, Δ(lacZYA-argF)U169, deoR, recA1, endA1, hsdR17 (rK–, mK+), phoA,
supE44, λ–, thi-1, gyrA96, relA1 (Promega).
Chủng vi khuẩn biểu hiện protein tái tổ hợp: E. coli BL21(DE3): F– ompT gal dcm
lon hsdSB(rB- mB-) λ(DE3 [lacI lacUV5-T7 gene 1 ind1 sam7 nin5]) (Promega). 3.1.3. Vector
Các vector biểu hiện protein tái tổ hợp trong vi khuẩn E.coli bao gồm: pET28a(+)
(Novagen), pE-SUMO3 (Life Sensor), pETM44 và pGAT (EMBL). Các vector này có
mang vùng T7 promoter để biểu hiện protein mục tiêu trong tế bào chất của E.coli. Các
vector này mang các đuôi dung hợp khác nhau: 6xHis (pET28(a)), 6xHis-protein MBP (pETM44), 6xHis-protein SUMO (pSUMO), 6xHis-protein GST (pGAT).
11
Vector pEGFP-E7: có mang tồn bộ gene E7 HPV 18 được chèn vào vị trí BglII và
SalI trong vùng MCS của vector pEGFP-C2, được tạo ra và bảo quản ở Phịng thí nghiệm
Sinh học phân tử - Đại học Khoa Học Tự Nhiên – ĐHQGTPHCM. 3.1.4. Chuột thí nghiệm
Chuột BALB/C (Viện Pasteur Nha Trang): chuột cái 6-8 tuần tuổi.
Chuột BALB/CBYJ (Charles River Laboratories France): chuột cái 6-8 tuần tuổi.
3.1.5. Bệnh phẩm
Bệnh phẩm là mẫu dịch phết cổ tử cung lấy bằng que phết và cytobrush hay thu nhận trong dung dịch ThinPrep của bệnh nhân hoặc người đến khám ở các bệnh viện : Bệnh viện Ung bướu - Thành phố Hồ Chí Minh (4/2011 - 5/2011) ; Bệnh viện Phụ sản Bán cơng Bình Dương (10/2012 – 12/2012) ; Bệnh viện Thủ Đức (09/2012 – 10/2012) ; Bệnh viện Hùng Vương (02/2013 – 05/2013). Các mẫu thu nhận ở BV Hùng Vươngđược cung cấp với kết quả Pap test.
3.1.6. Hóa chất-Mơi trường
3.1.6.1. Hóa chất
Các hóa chất dùng trong phản ứng PCR (Polymerase chain reaction)
- GoTaq Flexi DNA polymerase (Promega), Pfu polymerase (Promega).
- Mồi (primer) gồm hai loại : (1) mồi chung (universal) dùng trong phương pháp giải trình tự là T7 promoter 5’ TAATACGACTCACTATAGGG 3’ và T7 terminator 5’ GCTAGTTATTGCTCAGCGG 3’ có trình tự đã cơng bố ; (2) các mồi đặc hiệu cho các gene nghiên cứu dùng trong tạo dòng biểu hiện do chúng tôi thiết kế sẽ được trình bày trong phần Kết Quả tương ứng. Mồi được tổng hợp bởi công ty IDT (Hoa Kỳ) và công ty Sigma.
Thang phân tử DNA và thang protein (Fermentas)
- - - - - -
12
Hóa chất dùng trong tách chiết DNA plasmid từ vi khuẩn
Dung dịch I (glucose 50 mM, Tris-HCl (pH 8,0) 25 mM, EDTA (pH 8,0) 10 mM), dung dịch II (sodium dodecyl sulfate (SDS) 1 %, NaOH 0,2 M), dung dịch III (potassium acetate 3 M pH 5), RNase 10 mg/ml.
Hóa chất dùng cho phản ứng tạo dòng
Dung dịch CaCl2 100 mM lạnh, NdeI (New England Biolab), BsaI (Fermentas),
NheI, NcoI, SalI, T4 DNA ligase (Promega).
Hóa chất dùng cho cảm ứng biểu hiện protein
Dung dịch IPTG (isopropylthio-β-D-galactoside) 100 mM(Fermentas).
Hóa chất dùng cho điện di protein
- Dung dịch ly giải protein: NaCl 50 mM, EDTA 1 mM.
- Gel phân tách (separating gel) acrylamide 12 %: 3,3 ml dH2O, 4 ml acrylamide 30 %, 2,5 ml Tris-HCl 1,5 M (pH 8,8), 0,1 ml SDS 10 %, 0,1 ml APS 10 %, 30 µl TEMED - Gel gom (stacking gel): 2,8 ml dH2O; 0,66 ml acrylamide 30 %, 0,5 ml Tris-HCl 1M (pH 6,8), 0,04 ml SDS 10 %, 0,04 ml APS 10 %, 16 µl TEMED.
- Dung dịch nạp mẫu 5X (giữ ở 4oC): SDS 10 % (w/v), DTT 10 mM, Tris-HCl (pH 6,8)
0,2 M, glycerol 20 % (v/v), bromophenol blue 0,05 %.
- Dung dịch điện di 5X (giữ ở nhiệt độ phòng): 15,1 g Tris-base; 94 g glycine; 5 g SDS; thêm dH2O cho đủ 1l.
- Dung dịch nhuộm gel (giữ ở nhiệt độ phòng): 0,625 g coomassie brilliant blue, 112,5 ml ethanol tuyệt đối, 25 ml glacial acetic acid ; thêm dH2O (nước cất) cho đủ 250 ml.
- Dung dịch giải nhuộm (giữ ở nhiệt độ phòng): 100 ml glacial acetic acid, 100 ml ethanol tuyệt đối, 800 ml dH2O.
Hóa chất dùng cho Western blot
- Dung dịch điện chuyển 1X (giữ ở 4oC): 3,03 g Tris-base, 14,41 g glycine, 200 ml
methanol, thêm dH2O cho đủ 1 l.
- Dung dịch TBS 1X: 0,605 g Tris-base, 4,39 g NaCl, thêm dH2O đủ 500 ml. - Dung dịch TBST (dung dịch rửa): TBS + Tween 20 (1 %).
- Dung dịch khóa màng (membrane blocking): TBST + sữa gầy (5 %).
- KTĐD kháng protein p16INK4A, KTĐD kháng protein E7 HPV16 (Santa Cruz
Biotechnology), KT kháng đuôi 6xHis (Abcam).
13
- Dung dịch ly giải tế bào : M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent.
Hóa chất dùng cho tinh sạch protein tái tổ hợp
- Lysozyme 10 mg/ml.
- Dung dịch gắn cột (20 mM sodium phosphate, 50 mM NaCl, 40 mM imidazole, pH 7,4) - Dung dịch rửa cột (20 mM sodium phosphate, 50 mM NaCl, 100 mM imidazole pH 7,4) - Dung dịch dung ly (20 mM sodium phosphate, 50 mM NaCl, 500 mM imidazole, pH7,4).
Hóa chất dùng để gây đáp ứng miễn dịch trên động vật và thu nhận huyết thanh
- Tá dược Freund complete adjuvant, Freund incomplete adjuvant (Sigma).
- Dung dịch PBS (-) 1X, KH2PO4 (1,47 mM), Na2HPO4.2H2O (10 mM), KCl (2,7 mM), NaCl (137 mM), dung dịch PBS – BSA 1 % (PBS 1X + bovine serum albumin (BSA) (Sigma) 1 %), dung dịch PBS – Tween 0,05 % (PBS 1X + Tween 20 (Merck) 0,05 % ).
Hóa chất dùng trong ELISA kiểm tra đáp ứng miễn dịch của động vật
- Kháng thể đa dòng kháng IgG chuột đánh dấu alkaline phosphatase (Southern Biotech). - Cơ chất của enzyme alkaline phosphatase được pha trong dung dịch pha cơ chất (pH
9,8) có thành phần : Diethanolamine (Merck) 48,5 ml, MgCl2 4M 62,5 μl, ddH2O 500 ml.
Cách pha cơ chất (phosphatase substrate) (Sigma) : cho một viên cơ chất vào 5 ml dung dịch pha cơ chất. Lắc đến tan. Bảo quản ở -20C, tránh sáng.
Hóa chất dùng cho dung hợp tạo tế bào hydridoma:
PEG 1500 (Sigma), dung dịch NH4Cl 0,17 M (Merck), HAT 50X (Sigma), HT 50X (Sigma), trypan blue (Sigma).
Hóa chất dùng trong tinh sạch kháng thể đơn dòng
Bộ kit xác định isotype Isotrip (Santa Cruz Biotechnology), cột sepharose gắn protein A (GE Health Care), dung dịch gắn cột (Tris-HCl 0,1 M pH 7,5 , NaCl 0,15 M),
dung dịch dung giải (glycine 0,1 M pH 2,8), dung dịch trung hòa (Tris-HCl 1 M pH 9).
Hóa chất chuyển gene vào tế bào CHO-K1 và lai hóa miễn dịch tế bào trên lamelle
Lipofectamine 2000 (Invitrogen), poly-L-lysine (Sigma), PBS – PFA 3 % , PBS – triton X100 0,5 %, PBS – saponin (Sigma) 0,05 %, sữa gầy (Merck) 5 %, PBS – Tween (Merck) 0,1 %, H2O2 3%, DAB (2,4-diaminobutyric acid (Sigma), glycerol.
14
Lame kính có phủ silane (Dako), ethanol 95 %, ethanol 50 %, citrate pH6 10 mM, H2O2 3 %, PBS – Tween 0,1 %, DAB (2,4-diaminobutyric acid (Sigma), hematoxylin (Merck), glycerol.
Hóa chất biotin hóa kháng thể
NaHCO3 (Merck) 0.1M pH 9,5, NHS-D-biotin (Sigma), DMSO (Merck), PBS, túi thẩm tách, HABA/avidin (Sigma).
Hóa chất tạo đoạn DNA đánh dấu biotin
- Gotaq Master Mix (Promega). - Đoạn amplicon khuôn:
5’CTTTCGGTCGTGTCGGCCATCCTCGCCATCACTGCTGTGATTGCTGTATTTAT TGTGATTTTTAGGTATCACAACACTGTGACCAAGACCATCGAAACCCACACA GGCAATATCGAGACAAACATGGATGAAAACCTCCGCATTCCTGTGACTGCTG AGGTTGTTAACCCATCAAAGGCCTTTGTCGGTAGCTCCAACAC3’và 5’GTGTTGGAGCTACCGACAAAGGCCTTTGATGGGTTAACAACCTC AGCAGTCACAGGAATGCGGAGGTTTTCATCCATGTTTGTCTCGATATTGCCTG TGTGGTTTCGATGGTCTTGGTCACAGTGTTGTGATACCTAAAAATCACAATAA ATACAGCAATCACAGCAGTGATGGCGAGGATGGCCGACACGACCGAAAG3’ ; mồi xuôi 5’ biotin-GGTCGTGTCGGCCATCCTC 3’ và mồi ngược 5’ GGAGCTACCG ACAAAGGCCT 3’
Hóa chất cho immunoPCR
PBS, sữa gầy 5 % có bổ sung 0,1 mg/ml DNA tinh trùng cá hồi (Promega), sữa gầy 0,5 %, PBS-Tween 0,1 %, streptavidin (Sigma), Gotaq Green Master mix (Promega), PCR master mix (Promega), gel agarose (Biorad).
Hóa chất cho lai reverse dot blot (RDB) định type HPV
- Hóa chất xử lý mẫu: que lấy mẫu, dung dịch TE (Tris EDTA).
- Hóa chất tách chiết DNA: Dung dịch A (phenol pH 8, guanidinium isothiocyanate, glycerol, sodium acetate 3M pH 5,4), Dung dịch B (chloroform), Dung dịch C (isopropanol, coprecipitant), Dung dịch D (ethanol 70%), Dung dịch E (Tris, EDTA). - Hóa chất PCR-RDB: PCR-RDB Master mix.
- Gel agarose (1,8 %), dung dịch nạp mẫu, thang “181 cặp base”. - Dung dịch TAE 1X.
15
3.1.6.2 Môi trường
Môi trường Luria-Bertani (LB): 10 g NaCl, 10 g bacto tryptone, 5 g cao nấm men, hòa
tan trong H2O, chỉnh pH 7, thêm nước cho đủ 1 l. Hấp khử trùng ở 121°C - 30 phút.
Môi trường thạch LB: môi trường LB thêm agar 15 g/l.
Môi trường LB-kanamycin: môi trường LB bổ sung kanamycin để đạt nồng độ cuối là
30 µg/ml.
Mơi trường LB-ampicillin: môi trường LB bổ sung ampicillin để đạt nồng độ cuối là
100 µg/ml.
Mơi trường DMEM-Glutamax (Gibco) nuôi cấy tế bào u tủy P3X63Ag8.653 bổ sung
(FBS – fetal bovine serum, Gibco) 10 %, penicillin-streptomycin (Gibco) 1 %, HEPES (Gibco) 1 %.
Môi trường chọn lọc : môi trường HAT dùng chọn lọc tế bào lai là môi trường
RPMI1640 (Gibco) bổ sung các thành phần dung dịch HAT 1X (hypoxanthine 1 x 10-4M,
aminopterin 4 x 10-7 M, thymidine 1,6 x 10-5 M (Sigma), huyết thanh (FBS – fetal bovine
serum (Gibco) 20 %, penicillin-streptomycin (Gibco) 1 %, HEPES (Gibco) 1 %, NCTC 109 (Sigma) 10 %, amino acid không thiết yếu (Sigma) 1 %.
Môi trường EX-CELL Hybridoma : là mơi trường thương mại có chứa các thành phần
thay thế huyết thanh tăng cường khả năng sản xuất kháng thể của tế bào lai.
Môi trường E’MEM nuôi cấy tế bào HeLa và tế bào Beas-2b: bột môi trường E’MEM
(Sigma) 8,12 g/l, phenol đỏ 0,4 %, L-glutamine 2 mM, NaHCO3 0,1125 %, HEPES 20 mM, amphotericin-B 0,025 μg/ml, penicillin G 100 UI/ml, streptomycin 100 μg/ml, huyết thanh (FBS – fetal bovine serum) 10 %, chỉnh pH 7,2.
Môi trường Opti-MEM (Invitrogen): thành phần giống với môi trường E’MEM nhưng
lượng huyết thanh giảm một nửa.
Môi trường Ham’s Nutrient Mixture F12 nuôi tế bào CHO-K1: môi trường Ham’s
Nutrient Mixture F12 (Sigma), amphotericin-B 0,025 μg/ml, penicillin G 100 UI/ml, streptomycin 100 μg/ml, FBS 10 %, pH 7,2 – 7,4.
3.2. PHƯƠNG PHÁP
3.2.1. Phương pháp thiết kế mồi
Trình tự gene mục tiêu được thu nhận từ cơ sở dữ liệu NCBI. Các mồi và mẫu dò được thiết kế bằng phần mềm Beacon Designer 7.9 (PREMIER Biosoft International).
16
Thông số vật lý của mồi và mẫu dò được đánh giá bằng phần mềm OligoAnalyzer 3.1 (Integrated DNA Technologies). Phần mềm Clustal được sử dụng để kiểm tra các tính bảo tồn ở hai đầu của gene. Độ đặc hiệu của mồi và mẫu dò được kiểm tra bằng phần mềm BLAST (NCBI).
Các mồi được thiết kế để mang trình tự nhận biết của một loại enzyme cắt giới hạn để tạo thuận lợi cho q trình tạo dịng trong một vector xác định.
3.2.2. Phương pháp tách chiết DNA, RNA
3.2.2.1. Tách chiết DNA bộ gene
Tế bào (từ dịch nuôi cấy tế bào HeLa/Caski hay từ dịch phết cổ tử cung) được thu nhận bằng ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút. DNA được tách chiết dựa theo phương
pháp TriZol (Chomczynski & Sacchi, 1987). Bổ sung 900 l dung dịch TriZol
(guanidinium thiocyanate, phenol pH8, sodium acetate) vào 100 l dịch tế bào sau ly tâm. Lắc mạnh 5 giây rồi để yên 10 phút. Thêm 200 l dung dịch chloroform, trộn kỹ. Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút ở nhiệt độ phòng. Chuyển 600 l dịch nổi sang eppendorf
1,5 ml mới. Thêm 600 l dung dịch isopropanol. Trộn kỹ và để yên 10 phút. Ly tâm
13.000 vòng/phút trong 10 phút ở nhiệt độ phòng. Cẩn thận hút bỏ dịch nổi. Thêm 900 l dung dịch ethanol 70%. Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 5 phút ở nhiệt độ phòng. Cẩn
thận hút bỏ dịch nổi. Làm khơ cặn trong 10 phút ở 60C. Hịa cặn trong 50 l dung dịch
TE 1Xvà bảo quản DNA tách chiết ở 2-8C trong vòng 2-3 ngày hoặc ở -20C trong vòng 6 tháng.
3.2.2.2. Tách chiết DNA plasmid
Hoạt hóa tế bào E. coli DH5α có mang plasmid cần tách chiết bằng cách cấy
chuyền từ ống nghiệm giữ giống vào ống nghiệm chứa 2 ml mơi trường LB có bổ sung kanamycin 30 µg/ml (đối với các chủng mang vector pET-28a(+), pE-SUMO3, pETM44, pEGFP-C2) hoặc bổ sung ampicillin 100 µg/ml (đối với chủng mang vector pGAT). Nuôi cấy lắc qua đêm ở nhiệt độ 37°C. Ly tâm thu sinh khối (13.000vòng/phút, 5 phút). Bổ sung 100 µl dung dịch I (3.1.6.1) vào eppendorf chứa sinh khối vi khuẩn, vortex kỹ. Bổ sung 200 µl dung dịch II (3.1.6.1), đảo nhanh eppendorf nhẹ nhàng. Ủ trên nước đá 5 phút. Thêm 150 µl dung dịch III (3.1.6.1), đảo eppendorf thật kỹ cho đến khi thấy tủa trắng xuất hiện. Ủ 5 phút trong đá. Ly tâm với vận tốc 13.000 vòng/phút trong 10 phút ở 4°C. Chuyển dịch nổi từ eppendorf trên vào một eppendorf 1,5 ml mới. Bổ sung hai thể
17
tích ethanol tuyệt đối lạnh. Hịa tủa trong 20 µl TE 1X + 2 µl RNase 10 mg/ml, bảo quản ở -20°C.
3.2.2.3. Tách chiết RNA
Sinh khối tương đương 2x106 tế bào HeLa được dùng để tách chiết RNA với quy
trình tương tự nội dung 3.2.2.1, trong đó phenol pH 8 được thay bằng phenol pH 4 trong dung dịch TriZol.Cặn RNA được hòa lại trong 10µl H2O-DEPC (đã xử lý với
diethylpyrocarbonate), giữ ở - 20oC.
3.2.3. Phương pháp PCR và RT-PCR
Phương pháp PCR được sử dụng cho nhiều mục tiêu : nhân bản gene để tạo dịng và giải trình tự, chọn lọc các dịng có mang gene mong muốn, định týp HPV, thực hiện phản ứng immunoPCR. Đối với mỗi ứng dụng, các cặp mồi đặc hiệu và chương trình PCR phù hợp sẽ được trình bày trong nội dung tương ứng.
Phương pháp RT-PCR được sử dụng để nhân bản cDNA p16INK4A từ RNA của tế
bào HeLa. Phản ứng RT gồm : 10 µl dịch RNA, 1 µl reverse transcriptase (Agilent), H2O
–DEPC cho đủ 15 µl. Chương trình nhiệt RT : 20oC – 10 phút, 42oC - 1 giờ,72oC - 15
phút.
3.2.4. Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR
Để tinh sạch sản phẩm PCR từ gel agarose, chúng tôi sử dụng DNA extraction kit (Fermentas), với hướng dẫn sử dụng tóm tắt như sau : Vạch sản phẩm PCR có kích thước mong muốn được trích từ gel agarose sau điện di và làm tan ; mẫu được cho vào cột ly tâm (spin column) và sản phẩm tinh sạch được thu lại sau ly tâm.
Để tinh sạch sản phẩm PCR và sản phẩm cắt giới hạn : Cho 260 µl TE1X vào 40 µl sản phẩm PCR ; thêm 300 µl dung dịch phenol:chloroform:isoamylalcohol (25:24:1),
vortex 5 phút. Ly tâm 13.000 vòng/phút - 10 phút, ở 4oC, thu dịch nổi. Thêm 1 thể tích
chloroform, vortex 5 phút. Ly tâm 13.000 vòng/phút - 10 phút, ở 4oC, thu dịch nổi. Bổ
sung 1/10 thể tích dung dịch CH3COONa 3M pH 5,2, 1/20 thể tích glycogen 20 mg/ml và
2 thể tích ethanol tuyệt đối lạnh, đảo ống. Tủa trong -20oC - 2 giờ. Ly tâm 13.000 vòng/
phút - 20 phút để thu tủa. Rửa tủa bằng 1ml ethanol 70 % và ly tâm 13.000 vịng/ phút -
10 phút. Để tủa khơ ở 65oC, hoà vào 20 l TE 1X.
3.2.5. Phương pháp giải trình tự
Mẫu cần giải trình tự, sau khi tinh sạch, được gửi cho hãng Macrogen (Hàn quốc). Kết quả giải trình tự được xử lý theo hai bước: (1) so sánh với các dữ liệu trên ngân hàng
18
gene bằng phần mềm BLAST (NCBI) ; (2) sắp gióng cột và kiểm tra sự đồng khung giữa gene mục tiêu và plasmidbằng phần mềm Clustal X (SFI).
3.2.6. Phương pháp tạo dòng biểu hiện
Phương pháp tạo dòng biểu hiện dùng để tạo các vector tái tổ hợp mang các gene
E7 HPV 6/11/16, L1 HPV 18 và p16INK4A. Có 4 hệ vector được sử dụng là plasmid
pET28a(+), pE-SUMO3, pETM44 và pGAT nhưng cách tiến hành khơng có khác biệt, và
bao gồm ba bước : (1) tạo vector tái tổ hợp, (2) biến nạp vector tái tổ hợp vào E.
coliDH5α và E.coli BL21 (DE3), (3) chọn lọc dịng có mang gene mong muốn. 3.2.6.1. Tạo vector tái tổ hợp mang gene mong muốn
Thủy giải plasmid và sản phẩm PCR bằng các enzyme phù hợp (bảng1) theo
hai bước : bước 1, sản phẩm PCR và plasmid được cắt bằng enzyme cắt giới hạn I ; bước 2, plasmid và sản phẩm cắt giới hạn ở bước 1 được tiếp tục cắt bằng enzyme II.
Mỗi phản ứng thủy giải được tiến hành trong thể tích 40 µl : 2 µl plasmid /sản phẩm PCR (hoặc sản phẩm cắt giới hạn) với lượng khoảng 0,4-2 µg/phản ứng, 4 µl buffer 10 X, 4 µl BSA 10 X, 1 µl enzyme cắt giới hạn phù hợp (10 unit/ul) (bảng 1), 29 µl H2O đã loại bỏ nuclease (nuclease free), ủ ở nhiệt độ phù hợp trong 4 giờ. Sau đó, thu nhận sản