3.2.13. Phương pháp chuyển gene vào tế bào động vật
Gene cần chuyển được gắn chèn vào plasmid pEGFP. Cho 2 ml dịch huyền phù có
mật độ 3x105 tế bào vào giếng có chứa lamelle đã xử lý với poly-L-lysine. Ủ ở 37C, 5 %
CO2 cho đến khi tế bào đạt mật độ 90 – 95% trên bề mặt giếng. Thay môi trường Ham’s Nutrient Mixture trong giếng bằng 1 ml môi trường Opti - MEM. Pha lỗng 15 µg vector pEGFP-gene cần chuyển trong 100 µl mơi trường Opti – MEM. Pha loãng 6 µl lipofectamine 2000 trong mơi trường Opti – MEM để có 100 µl. Để ở nhiệt độ phòng trong 5 phút. Trộn vector và dung dịch lipofectamine, để ở nhiệt độ phòng trong 30 phút rồi cho vào giếng. Ủ ở 37C, 5 % CO2. Sau 4 giờ, thay môi trường Opti – MEM bằng môi trường Ham’s Nutrient Mixture. Ủ ở 37C, 5 % CO2 từ 14 – 44 giờ.
3.2.14. Phương pháp hóa tế bào miễn dịch (immunocytochemistry)
Phương pháp hóa tế bào miễn dịch được sử dụng để phát hiện biểu hiện các gene mục tiêu trong tế bào nuôi cấy và trong bệnh phẩm.
3.2.14.1.Phương pháp nhuộm miễn dịch tế bào trên lamelle
Đây là phương pháp phát hiện protein mục tiêu trong tế bào nuôi cấy (CHO,
HeLa). Phủ 2x105 tế bào trên lamelle và ủ ở 37C qua đêm. Rửa lamelle 2 lần với dung
dịch PBS. Cố định tế bào trên lamelle bằng 1,5 ml PFA 3 % - 10 phút ở nhiệt độ phòng. Làm thấm màng tế bào bằng 1,5 μl dung dịch PBS-triton X100 0,5 % trong 15 phút ở
27
nhiệt độ phòng. Rửa lamelle 2 lần với dung dịch PBS. Ủ lamelle với H2O2 3 % trong 10 phút, nhiệt độ phịng. Rửa PBS 2 lần. Khóa lamelle bằng 1,5 ml sữa gầy 5 % trong 1 giờ ở nhiệt độ phịng. Pha lỗng kháng thể sơ cấp trong dung dịch PBS- saponin 0,05 %. Ủ với 250 μl kháng thể sơ cấp qua đêm ở 4C. Rửa lamelle 3 lần (5 phút /lần) với dung dịch PBS- Tween 0,1 %.
Phát hiện huỳnh quang: Ủ lamelle với 250 μl kháng thể thứ cấp đánh dấu TRITC đối với phát hiện bằng huỳnh quang trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng. Rửa lamelle 3 lần (5 phút /lần) với dung dịch PBS- Tween 0,1 %. Nhuộm tương phản với Hoechst, quan sát dưới
kính hiển vi huỳnh quang ở vật kính 20X.
Phát hiện màu: Ủ lamelle với 250 μl kháng thể thứ cấp cộng hợp HRP trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng. Rửa lamelle 3 lần (5 phút /lần) với dung dịch PBS- Tween 0,1 %. Bổ sung 300 μl cơ chất DAB (Sigma) và cho hiện màu ở các mẫu. Rửa lại bằng PBS để dừng phản ứng. Cố định lamelle lên phiến kính, quan sát dưới kính hiển vi quang học ở vật kính 20 X.
3.2.14.2. Phương pháp lai hóa tế bào miễn dịch trên lame kính
Đây là phương pháp để xác định protein mục tiêu trong bệnh phẩm. Trải 10 µl huyền phù tế bào lên lame kính có phủ silane. Cố định trong ethanol 95 % trong 10 phút, để khơ ở nhiệt độ phịng từ 20 phút tới 1 giờ. Ngâm trong ethanol/nước cất 2 lần, 10 phút.
Ủ trong dung dịch bộc lộ kháng nguyên (Tris, EDTA, pH 9) đã làm nóng lên 950C, 20
phút. Để nguội xuống nhiệt độ dưới 50oC khoảng 30 phút. Rửa H2O 1 lần, rửa với dung
dịch rửa (PBS - Tween 0,1 %). Ủ trong H2O210 phút, nhiệt độ phòng. Rửa 2 lần với dung dịch rửa. Ủ với kháng thể sơ cấp trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng. Rửa lame 3 lần (5 phút /lần) với dung dịch rửa. Ủ lame với kháng thể thứ cấp cộng hợp HRP trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng. Rửa lame 3 lần (5 phút /lần) với dung dịch rửa. Bổ sung cơ chất DAB (Sigma) và cho hiện màu ở các mẫu trong 10 phút. Rửa lại bằng dung dịch rửa để dừng phản ứng. Nhuộm tương phản với hematoxylin từ 1-2 phút. Rửa lại bằng nước. Cố định lame với phiến kính, quan sát dưới kính hiển vi quang học ở vật kính 20X.
3.2.15. Phương pháp immunoPCR
Phương pháp này bao gồm ba cơng đoạn chính : (1) biotin hóa kháng thể phát hiện, (2) tạo đoạn DNA đánh dấu biotin, (3) immunoPCR.
3.2.15.1. Biotin hóa kháng thể
28
hịa tan trongNaHCO3 0,1M. Dựa vào cơng thức có sẵn xác định tỉ lệ mol biotin/kháng
thể và lượng thể tích biotin 1mg/ml tương ứng với lượng kháng thể cần đánh dấu. Khuấy nhẹ dung dịch kháng thể và bổ sung từ từ dung dịch biotin/DMSO vào.Ủ hỗn hợp ở nhiệt
độ phòng trong 4 giờ, có khuấy nhẹ. Thẩm tích trong PBS qua đêmở 40C để tinh sạch
kháng thể đánh dấu biotin. Đánh giá mức độ biotin hóa kháng thể sử dụngHABA/avidin theo hướng dẫn của nhà sản xuất.