PHẦN 4 KẾT QUẢ
4.3. TẠO KTĐD KHÁNG PROTEIN E7HPV 16 VÀ p16INK4A
Các bước tạo KTĐD được tiến hành theo lưu đồ sau :
4.3.1. GÂY ĐÁP ỨNG MIỂN DỊCH CHUỘT VỚI KHÁNG NGUYÊN MỤC TIÊU
Chuột được sử dụng cho việc tạo KTĐD là chuột BALB/c được nhập từ nước ngoài (Charles River Laboratories-France). Tuy nhiên do việc nhập khẩu động vật sống phải qua rất nhiều thủ tục phức tạp với chi phí rất cao nên chúng tơi đồng thời tiến hành thí nghiệm trên dịng chuột BALB/c đã được ni và thuần hóa trong nước (Viện Pasteur Nha Trang).
Đối với mỗi loại kháng nguyên, chúng tôi gây đáp ứng miễn dịch 2 chuột BALB/c với kháng nguyên tái tổ hợp tinh sạch. Tính đáp ứng miễn dịch của chuột trước và sau khi gây đáp ứng miễn dịch với kháng nguyên tái tổ hợp được xác định bằng phương pháp ELISA. Hiệu giá huyết thanh của chuột được tính tốn dựa trên phương pháp đề xuất bởi Helen và cộng sự (2001). Nếu hiệu giá huyết thanh lớn hơn 1.000 thì có thể thu nhận lách chuột cho thí nghiệm dung hợp.
4.3.1.1. Gây đáp ứng miễn dịch chuột với kháng nguyên E7 HPV 16 tái tổ hợp
Gây đáp ứng miễn dịch của chuột BALB/c đối với protein E7 HPV 16 và p16INK4A
Kiểm tra đáp ứng miễn dịch chuột
Thu lách chuột có đáp ứng miễn dịch tốt
Dung hợp tế bào lách với tế bào myeloma P3X63Ag8.653
Sàng lọc hybridoma trên mơi trường RPMI – HAT Chọn lọc dịng tạo KTĐD mục tiêu
Tách, nhân dịng, ni cấy tế bào hybridoma Thu nhận dịch nuôi cấy và tinh sạch KTĐD
53
Hình 25. Kết quả ELISA trên huyết thanh của 2 chuột trước và sau khi gây đáp ứng miễn dịch với protein E7 HPV16
Hiệu giá huyết thanh của hai chuột (Charles River Laboratories-France) được gây đáp ứng miễn dịch với protein E7 HPV 16 đều lớn hơn 1.000 (hình 25, phụ lục 5) ; trong đó chuột 1 cho hiệu giá lớn nhất (nằm trong khoảng từ 12.800 đến 25.600 so với từ 3.200 đến 6.400 của chuột 2) nên được chọn để gây đáp ứng miễn dịch tăng cường và thu nhận lách cho thí nghiệm dung hợp tạo KTĐD kháng E7 HPV 16.
4.3.1.2. Gây đáp ứng miễn dịch chuột với kháng nguyên p16INK4A tái tổ hợp
Hình 26. Kết quả ELISA trên huyết thanh của 4 chuột trước và sau khi gây đáp ứng miễn
dịch với protein p16INK4A
Hiệu giá huyết thanh của bốn chuột (hai từ Charles River Laboratories-France và
hai từ Viện Pasteur Nha Trang) được gây đáp ứng miễn dịch với protein p16INK4Alà tương
đương nhau và đều lớn hơn 1.000 (hình 26, phụ lục 6). Chuột 2 (Charles River Laboratories France) và 4 (Viện Pasteur Nha Trang) được chọn cho thí nghiệm dung hợp (đều có hiệu giá nằm trong khoảng 3.200 đến 6.400).
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 1/501/100 1/200 1/400 1/800 1/16 00 1/32 00 1/64 00 1/12 800 1/25 600 1/51 200 1/10 2400
Độ pha loãng huyết thanh
OD 40 5 n m chuột 1 chuột 2 chuột 3 chuột4 Huyết thanh trước khi tiêm
0.000 0.500 1.000 1.500 2.000 2.500 3.000 3.500 1/501/100 1/20 0 1/40 0 1/80 0 1/16 00 1/32 00 1/64 00 1/12 800 1/25 600 1/51 200
Độ pha loãng huyế t thanh
OD 405
n
m
Chuột 1 Chuột 2 Huyết thanh trước khi tiêm
54
4.3.2. CHỌN LỌC DÒNG HYBRIDOMA SẢN XUẤT KTĐD KHÁNG PROTEIN E7 HPV 16 VÀ p16INK4A HPV 16 VÀ p16INK4A
Các tế bào sau khi dung hợp được nuôi cấy trên môi trường chọn lọc có bổ sung HAT (hypoxanthine, aminopterin và thymidine). Trong môi trường HAT chỉ những tế bào hybridoma là tế bào dung hợp giữa tế bào lách chuột và tế bào u tủy mới có khả năng sống và tăng trưởng cịn tế bào khơng dung hợp sẽ chết.
Chúng tôi sử dụng phương pháp ELISA trực tiếp với kháng nguyên tái tổ hợp E7
HPV16 hoặc p16INK4A để sàng lọc các giếng có tế bào lai sản xuất kháng thể mục tiêu.
4.3.2.1 KTĐD kháng protein E7 HPV16
Trong tổng số 10 đĩa 96 giếng, có sự xuất hiện dịng tế bào lai ở 102 giếng. Như vậy, hiệu suất của thí nghiệm dung hợp tế bào đạt được là 10,6 %.
Hình 27. Biểu đồ thể hiện kết quả sàng lọc các dịng hydridoma có khả năng tạo kháng thể kháng E7 HPV 16 trên 102 giếng tế bào lai ở 10 đĩa 96 giếng.
Kết quả ELISA (hình 27, phụ lục 7) sàng lọc 102 giếng cho thấy tế bào lai trong hai giếng 2C1 và 6B10 sản xuất KTĐD kháng protein E7 HPV 16 trong môi trường ni cấy. Hai dịng hybridoma này được “tạo dòng đơn” (subcloning) bằng phương pháp pha loãng tới hạn đến mật độ 1 tế bào/giếng. Khi tế bào đạt độ phủ 70-80 % bề mặt giếng, chúng tôi kiểm tra khả năng sản xuất kháng thể mục tiêu bằng phương pháp ELISA lần hai. Quá trình trên được lặp lại hai lần nhằm thu nhận các dòng đơn tế bào hydridoma đồng nhất về mặt di truyền có khả năng sản xuất KTĐD ổn định. Các dòng đơn hydridoma này được tiếp tục nhân dòng và bảo quản bằng phương pháp đông lạnh và giữ trong nitơ lỏng. Chúng tơi chọn dịng 2C1 cho nghiên cứu tiếp theo.
6B10, 1.586 2C1; 1.71 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 Vị trí các giếng OD 4 05 nm
55
4.3.2.2 KTĐD kháng protein p16INK4A
Đối với chuột 2, trong tổng số 10 đĩa 96 giếng, có 84 giếng xuất hiện dịng tế bào lai. Trong khi đó, chỉ có 41 giếng trong 20 đĩa 96 giếng có tế bào lai đối với kết quả dung hợp của chuột 4. Như vậy, hiệu suất của thí nghiệm dung hợp tế bào ở chuột 2 và 4 lần lượt là 8,75 % và 2,13 %. Chúng tôi tiến hành chọn 49 giếng có tế bào lai phát triển tốt đem đi sàng lọc. Kết quả sàng lọc bằng ELISA cho thấy có 6 dịng cho tín hiệu dương tính (hình 28, phụ lục 8).
Các dòng tế bào lai được nhân lên để chọn dịng đơn. Trong đó, dịng 1C10 cho tín hiệu cao và ổn định khi kiểm tra bằng ELISA, cho nên chúng tơi sử dụng dịng này để tiếp tục q trình chọn dịng đơn nhằm thu nhận dòng tế bào dùng cho sản xuất kháng thể
kháng protein p16INK4A. Các dòng còn lại được bảo quản và giữ trong nitơ lỏng.
Hình 28 . Biểu đồ thể hiện kết quả sàng lọc các dịng hydridoma có khả năng tạo
kháng thể kháng p16INK4A trên 49 giếng tế bào lai ở 10 đĩa 96 giếng.
4.3.3. THU NHẬN VÀ TINH SẠCH KTĐD KHÁNG E7 HPV 16 VÀ p16INK4A
4.3.3.1. Kết quả xác định isotype KTĐD kháng E7 HPV 16 và p16INK4A
Chúng tơi xác định isotype của KTĐD từ dịng 2C1 và 6B10 để lựa chọn phương pháp tinh sạch kháng thể phù hợp nhất. Isotype của KTĐD được xác định bằng kit Isotyping (BD), hoạt động theo nguyên tắc ELISA “sandwich”. Trong đó, các kháng thể đặc hiệu cho từng isotype của chuột như kháng thể kháng IgG1, kháng IgG2a, kháng IgG2b, kháng IgG3, kháng IgM, kháng IgA, Igκ và Igλ được cố định ở những giếng khác nhau trên đĩa 96 giếng. Dịch nổi từ môi trường ni cấy các dịng tế bào lai có chứa
56 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4
IgG1 IgG2a IgG2b IgG3 IgM IgA Igκ Igλ
2C1 6B10 (-) (+) O D 4 5 0 n m
kháng thể mục tiêu sẽ bị bắt giữ bởi một trong các loại kháng thể trên. Sau đó, KTĐD bị bắt giữ sẽ được phát hiện bởi một kháng thể phát hiện cộng hợp với enzyme.
Kháng thể kháng protein E7 HPV16
Kết quả (hình 29) cho thấy KTĐD 2C1 có chuỗi nặng là IgG1 và chuỗi nhẹ là κ, cịn KTĐD 6B10 có chuỗi nặng là IgG3 và chuỗi nhẹ là κ.
Chúng tôi chọn KTĐD 2C1 kháng E7 HPV 16 cho các nội dung tiếp theo.
Hình 29. Kết quả xác định isotype của các KTĐD kháng protein E7 HPV 16 sản xuất bởi dòng tế bào lai 2C1 và 6B10 bằng bộ Isotyping ELISA Kit (BD)
Kháng thể kháng protein p16INK4A
Hình 30. Kết quả xác định isotype của các KTĐD kháng protein p16INK4A sản xuất bởi dòng tế
bào lai 1C10 và 5A1 bằng bộ Isotyping ELISA Kit (BD)
Kết quả (hình 30) cho thấy KTĐD 1C10 có chuỗi nặng là IgG1 và chuỗi nhẹ là κ, cịn KTĐD 5A1 có chuỗi nặng là IgG2b và chuỗi nhẹ là κ.
Chúng tôi chọn KTĐD 1C10 kháng p16INK4A cho các nội dung tiếp theo.
0 0.5 1 1.5 2 2.5
IgG1 IgG2a IgG2b IgG3 IgM IgA Igκ Igλ
1C10 5A1 (-) (+)
57
4.3.3.2. Kết quả tinh sạch KTĐD kháng protein E7 HPV 16 và p16INK4A
Các KTĐD được sản xuất bằng phương pháp ni cấy tế bào lai in vitro. Dịng tế
bào lai bảo quản bằng đông lạnh được hoạt hóa bằng cách giải đông nhanh ở 37oC và
được ni cấy trong bình Roux 25 cm2. Sau 1-2 tuần, tế bào được chuyển qua những thể
tích lớn dần trong bình Roux 75 cm2, 175 cm2. Khi tế bào phát triển đến giai đoạn bão
hòa và bắt đầu chết thì dịch nổi được thu nhận qua ly tâm. Dịch nổi chứa KTĐD được
cho qua cột sắc ký ái lực với protein G là một protein chiết xuất từ vi khuẩnStreptococci
nhóm C và G và có ái lực mạnh với vùng Fc của phân tử IgG1 chuột.
Chúng tôi sử dụng phương pháp sắc ký ái lực với cột protein G để tinh sạch KTĐD từ dịch nổi môi trường nuôi cấy dòng tế bào 2C1 và 1C10. Chúng tôi kiểm tra độ tinh sạchcủa KTĐD thu nhận được bằng phương pháp SDS-PAGE và định lượng bằng phương pháp đo mật độ quang ở bước sóng 280 nm.
Hình 31. Kết quả điện di SDS-PAGE KTĐD 2C1. Giếng 1: 5 µg KTĐD 2C1 ; giếng 2: Thang phân tử lượng protein.
Kết quả điện di SDS-PAGE (hình 31) phân đoạn KTĐD sau tinh sạch cho thấy chúng tôi đã thu nhận được KTĐD 2C1tinh sạch. KTĐD thu nhận được gồm hai chuỗi polypeptide có kích thước lần lượt khoảng 50 kDa và 25 kDa, tương ứng với chuỗi nặng và chuỗi nhẹ của phân tử IgG.
Hình 32. Kết quả điện di SDS-PAGE KTĐD 1C10. Giếng 1: 5 μg KTĐD 1C10 ; giếng 2: Thang phân tử lượng protein.
50 kDa 25 kDa
58
Tương tự như vậy, kết quả điện di SDS-PAGE phân đoạn KTĐD sau tinh sạch (hình 32) cho thấy chúng tôi cũng đã thu nhận được KTĐD 1C10 tinh sạch gồm 2 chuỗi polypeptide có kích thước khoảng 50 kDa và 25 kDa, tương ứng với chuỗi nặng và chuỗi nhẹ của phân tử IgG.
4.3.4. KIỂM TRA VÀ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CỦA KTĐD
Chúng tôi xác định một số đặc tính của KTĐD tinh sạch như : ái lực của KTĐD với kháng nguyên, tính đặc hiệu và khả năng tương tác của KTĐD với kháng nguyên.
4.3.4.1. Kết quả xác định ái lực của KTĐD với kháng nguyên tái tổ hợp
Hằng số ái lực Kaff phản ánh lực tương tác của KTĐD với kháng nguyên mục tiêu và quyết định độ nhạy của các phương pháp sử dụng KTĐD để phát hiện kháng nguyên.
Theo Ohlson và cộng sự (1997), những tương tác có Kaff > 104 M-1 được xem là các tương
tác mạnh. Từ đồ thị biểu diễn giá trị OD405 của phản ứng ELISA theo các nồng độ kháng
nguyên và KTĐD sử dụng (hình 33, phụ lục 9), có thể tính được hằng số ái lực Kaff dựa
theo cơng thức (3.2.12.1).
Hình 33. Đồ thị xác định hằng số ái lực của KTĐD 2C1 với kháng nguyên E7 HPV16
Từ cách tính tốn trên, chúng tơi xác định được hằng số ái lực của KTĐD 2C1 là
1,12 ± 0,21 x 109M-1. Giá trị này cho thấy KTĐD 2C1 có ái lực mạnh với protein E7
HPV16.
Tương tự như trên, từ đồ thị hình 34 (phụ lục 9) có thể tính được hằng số ái lực của
KTĐD 1C10 là 1,05 ± 0,28 x 108 M-1. Giá trị này cho thấy KTĐD 1C10 có ái lực mạnh
59
Hình 34. Đồ thị xác định hằng số ái lực của KTĐD 1C10 với kháng nguyên p16INK4A
4.3.4.2. Kết quả kiểm tra tính đặc hiệu của KTĐD
Chúng tơi kiểm tra tính đặc hiệu của KTĐD 2C1 và 1C10 bằng phương pháp Western blot trên kháng nguyên tái tổ hợp và trên dịch chiết tế bào biểu hiện kháng nguyên tự nhiên.
Kháng thể 2C1 kháng protein E7 HPV16
Chúng tơi kiểm tra tính đặc hiệu của KTĐD 2C1 với protein E7 HPV16 tái tổ hợp bằng phương pháp Western blot. KTĐD kháng protein E7 HPV16 thương mại (Santa Cruz) được chọn làm chứng dương cho thí nghiệm.
Hình 35. Kết quả SDS-PAGE và Western blot trên KTĐD kháng E7 HPV 6, E7 HPV 11, E7 HPV 16, E7 HPV 18 với các protein tái tổ hợp tương ứng. (A) Điện di SDS-PAGE các protein
tái tổ hợp. Giếng M: thang protein ;giếng 1, 2, 3, 4: protein tái tổ hợp E7 HPV 16, E7 HPV 16, E7 HPV 11, E7 HPV 18. (B) KTĐD 2C1;giếng 1, 2, 3, 4: protein tái tổ hợp E7 HPV 16, E7 HPV
6, E7 HPV 11, E7 HPV 18.(C) KTĐD kháng E7 HPV 16 thương mại (Santa Cruz);giếng 1, 2, 3, 4: protein tái tổ hợp E7 HPV 18, E7 HPV 11, E7 HPV 6, E7 HPV 16.
Kết quả điện di SDS-PAGE (hình 35A, giếng 1) cho thấy sự xuất hiện một vạch có kích thước khoảng 20 kDa phù hợp với kích thước mong đợi của protein E7 HPV 16 tái tổ hợp. Kết quả Western blot sử dụng KTĐD 2C1 và KTĐD thương mại đều cho thấy sự xuất hiện một vạch tín hiệu dương tính tương ứng với kích thước mong đợi cho protein
~ 25 kDa
60
tái tổ hợp (hình 35B, giếng 1 và C, giếng 4). Khơng thấy xuất hiện tín hiệu ở các giếng chứa các protein khác như E7 HPV 6/11/18. Kết quả trên cho thấy : (1) KTĐD 2C1 tương tác đặc hiệu với protein E7 HPV 16 giống như KTĐD thương mại và không cho phản ứng chéo với protein E7 của các type 6, 11, 18 ; (2) KTĐD 2C1 tương tác với epitope dạng thẳng của protein E7 HPV 16 tái tổ hợp.
Tiếp theo, chúng tôitiếp tục sử dụng phương pháp Western blot để phát hiện protein E7 trong dịch ly giải tế bào CaSki. Chúng tôi chọn tế bào CaSki cho các thí nghiệm này vì đây là dịng tế bào UTCTC được ghi nhận có chứa khoảng 600 bản sao DNA của virus HPV 16 trong bộ gene và biểu hiện tự nhiên protein E7 HPV 16 với kích thước vào khoảng 20 kDa. Bên cạnh đó, dịng tế bào UTCTC C-33 A khơng mang DNA của HPV 16 được chọn làm chứng âm để kiểm tra tính đặc hiệu của KTĐD.
Hình 36. Kết quả Western blot giữa KTĐD 2C1 với dịch ly giải tế bào CaSki, C-33 A và protein E7 HPV-16 tái tổ hợp. Giếng M: thang phân tử lượng protein; giếng 1: 50 µg dịch ly giải tế bào CaSki ; giếng 2: 5 µg protein E7 HPV 16 tái tổ hợp; giếng 3:50 µg dịch ly giải tế bào
C-33 A.
Ở các giếng chứa protein tổng số của tế bào CaSki và protein E7 HPV 16 tái tổ hợp (hình 36, giếng 1 và 2) đều xuất hiện tín hiệu lai ở vị trí có kích thước khoảng 20 kDa tương ứng với kích thước dự đốn của protein E7. Tín hiệu lai khơng xuất hiện ở giếng chứa protein tổng số từ tế bào C-33 A (hình 36, giếng 3). Như vậy, KTĐD 2C1 tương tác đặc hiệu với cả protein tái tổ hợp lẫn protein biểu hiện tự nhiên trong tế bào CaSki.
Kháng thể 1C10 kháng protein p16INK4A
Tương tự, chúng tôi kiểm tra tính đặc hiệu của KTĐD 1C10 với protein p16INK4A
tái tổ hợp và protein p16INK4A từ dịch ly giải tế bào HeLa bằng phương pháp Western blot.
KTĐD kháng protein p16INK4A thương mại (Santa Cruz) là chứng dương cho thí nghiệm.
Kết quả SDS-PAGE cho thấy sự xuất hiện một vạch kích thước khoảng 18,4 kDa
61
blot cho thấy tín hiệu dương tính với cả KTĐD 1C10 (hình 37, giếng 2) và KTĐD thương
mại (hình 37, giếng 3) ở vạch dự đốn cho p16INK4A tái tổ hợp. Như vậy, KTĐD 1C10 có
khả năng tương tác với các epitope dạng thẳng của protein p16INK4A tái tổ hợp.
Hình 37. Kết quả SDS-PAGE và Western blot trên KTĐD 1C10 với protein p16INK4A tái tổ
hợp. Giếng (M) thang protein; giếng (1) điện di SDS-PAGE protein p16INK4A tái tổ hợp;
giếng (2) lai KTĐD 1C10 với protein p16INK4A tái tổ hợp đã được biến tính; giếng (3) lai
KTĐD thương mại với protein p16INK4A tái tổ hợp đã được biến tính
Hình 38. Kết quả Western blot của các KTĐD 1C10 và thương mại với dịch ly giải tế bào
HeLa, MCF7 và protein p16INK4Atái tổ hợp. Giếng M: thang phân tử lượng protein; giếng 1: 5
μg protein p16INK4A tái tổ hợp, giếng 2: 50μgdịch ly giải tế bào HeLa, giếng 3:50 μg dịch ly giải
tế bào MCF7.
Kết quả Western blot sử dụng KTĐD 1C10 (hình 38 A) và KTĐD thương mại
(hình 38 B) với protein p16INK4A tái tổ hợp (hình 38 A/B, giếng 1) và protein tổng số của
tế bào HeLa (hình 38 A/B, giếng 2) đều cho thấy tín hiệu lai ở vị trí tương ứng với kích
thước dự đốn của p16INK4A. Trong khi đó, tín hiệu lai khơng xuất hiện ở giếng có protein
tổng số từ tế bào MCF-7 (hình 38 A/B, giếng 3). Như vậy, KTĐD 1C10 có phản ứng đặc
hiệu với protein p16INK4A tự nhiên tồn tại trong dòng tế bào UTCTC HeLa.
62
Sử dụng phần mềm ImageJ để phân tích kết quả điện di SDS-PAGE (phụ lục 10) phân đoạn KTĐD sau tinh sạch, chúng tôi xác định được độ tinh sạch của KTĐD 2C1
(kháng E7 HPV 16), 1C10 (kháng p16INK4A), 4H5 (kháng E7 HPV 18) và 1D5 (kháng E7
HPV 18) lần lượt là 95,17 %, 92,01 %, 90,32 % và 98,73 %.
4.4. KHẢO SÁT MỘT SỐ THÔNG SỐ CHO QUY TRÌNH TẠO KTĐD
Chúng tơi xác định những thơng số trong quy trình cần tối ưu hóa để đạt được hiệu