69
Trước tiên, chúng tôi khảo sát một số thông số và từ những thơng số đã tối ưu hóa, chúng tơi xây dựng quy trình immunoPCR. Đối tượng nghiên cứu là protein E7 HPV 18.
Chúng tôi tạo hai phức hợp : KTĐD bắt giữ đánh dấu biotin và DNA đánh dấu biotin. Sau đó chúng tơi khảo sát nồng độ tối ưu của các thành phần sử dụng trong quy trình immunoPCR bao gồm : kháng thể phủ giếng, kháng thể bắt giữ đánh dấu biotin, streptavidin và DNA đánh dấu biotin.
4.5.1. TẠO KTĐD 4H5 ĐÁNH DẤU BIOTIN
Biotin và các dẫn xuất của nó có khả năng liên kết với nhóm amine và nhóm thiol của protein hoặc nhóm aldehyde của glycoprotein. Phương pháp đơn giản và phổ biến nhất để đánh dấu KTĐD là gắn n h ó m succinimidyl ester của biotin vào nhóm ε-amino của lysine trên kháng thể.
Chúng tơi biotin hóa kháng thể phát hiện 4H5 bằng NHS-D-Biotin (Sigma) với tỷ lệ 125 µl dung dịch biotin 1 mg/ml cho 1 mg KTĐD theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Sau đó, chúng tơi tiến hành đánh giá mức độ biotin hóa kháng thể (tức là tỷ lệ số mole phân tử biotin trên số mole phân tử kháng thể) bằng bộ kit HABA/Avidin (Sigma). Tỷ lệ
70
số mole biotin: số mole kháng thể thu được là 10, tức là trung bình trên 1 phân tử kháng thể có gắn khoảng 10 phân tử biotin, so với tỷ lệ đánh dấu trung bình là từ 3-8 phân tử biotin / phân tử kháng thể.
Ái lực của KTĐD 4H5-biotin với kháng nguyên mục tiêu E7 HPV18 được kiểm tra bằng phương pháp ELISA. Kết quả (hình 46, phụ lục 14) cho thấy hằng số ái lực của
4H5-biotin là 4,4±3x108(M-1).