3.2.15.2. Tạo đoạn DNA chỉ thị đánh dấu biotin (DNA-biotin)
Sử dụng phương pháp PCR với cặp mồi đánh dấu biotin ở một đầu,mạch khn là hai trình tự DNA nhân tạo bổ sung dài 200 bp.Sản phẩm PCR là một trình tự DNA mạch đơi dài 200 bp đánh dấu biotin ở đầu 5’, được tinh sạch bằng phenol-chloroform và đo nồng độ bằng máy Nanodrop. Sự biotin hóa đoạn DNA được kiểm tra bằng kit Southern blot (Fermentas).
3.2.15.3. ImmunoPCR: sử dụngkiểu “sandwich” (hình 4) với KTĐD “bắt giữ” và
KTĐD“phát hiện” đánh dấu biotin. Phương pháp gồm hai bước : bước 1 thực hiện trên
đĩa ELISA và bước 2 thực hiện trong tube PCR.
Phủ giếng trong đĩa ELISA bằng 50 µl KTĐD “bắt giữ“ pha loãng trong
PBS, ủ qua đêm ở 40C. Rửa 4 lần bằng PBS-Tween 0,1 %. Khóa giếng bằng 300 µl
dung dịch sữa gầy 5 % có bổ sung 0,1 ng/ml DNA tinh trùng cá hồi. Rửa 4 lần bằng PBS-Tween 0,1 %. Bổ sung dịch kháng nguyên mục tiêu pha trong sữa gầy 0,5 % vào giếng. Ủ 2 giờ ở nhiệt độ phòng. Rửa 10 lần bằng PBS-Tween 0,1 %. Ủ giếng với 50 µl KTĐD “phát hiện” đánh dấu biotin - 90 phút - nhiệt độ phòng. Rửa 10 lần bằng PBS- Tween 0,1 %. Thêm 50 µl streptavidin vào giếng, ủ 1 giờ ở nhiệt độ phòng. Rửa 10 lần
29
bằng PBS-Tween 0,1 %. Thêm 50 µl DNA đánh dấu biotin. Ủ 30 phút. Rửa 15 lần bằng 300 µl PBS-Tween 0,1 % và 10 lần bằng 200 µl nước cất 2 lần khử trùng. Để khơ. Thêm
50 µl hỗn hợp PCR vào giếng. Đun 960C, 5 phút. Chuyển toàn bộ hỗn hợp
từ giếng sang tube và chạy chương trình PCR: (950C-5‘, 950C-30“, 550C-
30“,720C-1‘, 30 chu kì, 720C-6‘, điện di ; hoặc chạy chương trình realtime
PCR (950C-15‘, 950C-30“, 550C-30“,720C-1‘, 40 chu kì, 720C-5‘, 950C-1‘,
30
PHẦN 4. KẾT QUẢ
4.1. TẠO PROTEIN TÁI TỔ HỢP E7 HPV 6/11/16, L1 HPV 16/18 VÀ p16INK4A
Việc tạo các protein tái tổ hợp E7 HPV 6/11/16, L1 HPV 16/18 và p16INK4A được
tiến hành theo lưu đồ sau đây :
4.1.1. CHUẨN BỊ NGUYÊN LIỆU CHO TẠO DÒNG
4.1.1.1 Thiết kế mồi cho phản ứng PCR nhân bản các gene E7 HPV 6/11/16,
L1 HPV 16/18 và p16INK4A
Các cặp mồi đặc hiệu dùng nhân bản gene E7 HPV 6/11/16, L1 HPV 16/18 và
gene p16INK4A được thiết kế để mang thêm trình tự nhận biết của các enzyme cắt giới
hạn,tạo thuận lợi cho việc tạo dòng gene vào các hệ vector khác nhau (bảng 4).
Các cặp mồi này được kiểm tra về một số đặc tính quan trọng như khả năng hình thành primer dimer, khả năng tạo cấu trúc thứ cấp, bằng phần mềm OligoAnalyzer (IDT)
và tính đặc hiệu in silico bằng phần mềm BLAST (NCBI) (phụ lục 1).
Bảng 4. Các cặp mồi sử dụng để nhân bản các gene mục tiêu
STT Protein Vector Tên mồi Trình tự Kích
thước
1.
p16
pET-28(a) p16f-Nde 5’CGGGGAGCCATATGGAGCCGGCGG 3’
417 bp 2. pSUMO p16f-Bsa 5’GAGCAGCGGTCTCTAGGTATGGAGCCG
GCGGCGG3’
4.1.1. CHUẨN BỊ NGUYÊN LIỆU CHO TẠO DÒNG
4.1.1.1. Thiết kế mồi cho phản ứng PCR nhân bản các gene tương ứng 4.1.1.2. Thu nhận các gene tương ứng từ bệnh phẩm nhiễm HPV
4.1.2. DỊNG HĨA GENE MỤC TIÊU VÀO VECTOR pET28a(+), pE-SUMO3, pETM-44, pGAT VÀ KIỂM TRA VECTOR TÁI TỔ HỢP BẰNG PCR VÀ GIẢI TRÌNH TỰ
4.1.3. BIỂU HIỆN PROTEIN TÁI TỔ HỢP VÀ KIỂM TRA CHÚNG BẰNG SDS-PAGE VÀ WESTERN BLOT
31
3. pETM44
và pGAT p16f-Nco 5’GGAGCAGCCATGGAGCCGGCGGCGG3’
4. pET-28(a), pSUMO, pETM44 và pGAT p16r-Sal 5’CCTCTCTGGTCGACTCAATCGGGGATGT CTG3’ 5. E7/16 pET-28(a) E7/16f- Nde 5’AACCCAGCTGTACATATGCAT GGA ACACC3’ 297 bp 6. pSUMO E7/16f-Bsa 5’GAAACCGGTCTCAGGTATGCA 3’
7. pETM44 và pGAT E7/16f- Nco 5’GCGATATTACATATCCATGGACCTAA3’ 8. pET-28(a), pSUMO, pETM44 và pGAT E7/16r-Sal 5’TCTACCATGGCGTCGACTTATGGTTT 3’ 9. E7/11 pET28(a) E7/11f- Nde 5’CTGCTGGACAACACATATGGAAGACTTG 3’ 10. E7/11r-Sal 5’CTGAATCGTCCGTCGACCTTGTTATGGT TTTG 3’ 11. E7/6 pET28(a) E7/6f-Nde 5’ACACTGCTGGACCATATGCATGGAAGAC ATG 3’ 12. E7/6r-Sal 5’TGAATCGTCAGTCGACGTTGTTATGTCT TCG 3’ 13. L1/16 pET28(a) L1/16f- Nhe 5’CATATTTTTGCTAGCATGTCTCTTTGGCT GCCT3’ 1596 bp 14. L1/16r- Hind 5’GTACATAAAGCTTTTACAGCTTACGTTTT TTGCGTTT3’ 15. L1/18 pET28(a) L1/18f- Eco 5’CCCGAATTCATGTGCCTGTATACACG GGTC3’ 1707 bp 16. L1/18r- Xho 5’CCCCTCGAGTTACTTCCTGGCACGTA CACG3’
Ghi chú : trình tự nhận biết của các enzyme cắt giới hạn được in đậm và gạch chân.
4.1.1.2. Thu nhận các gene cần tạo dịng
Chúng tơi tiến hành phản ứng PCR nhân bản các gene E7 HPV 6/11/16, L1 HPV
16/18 và p16INK4A từ bệnh phẩm đã được định týp và kiểm tra bằng giải trình tự. Để gắn
32
trình tự cắt giới hạn phù hợp. Enzyme sử dụng là Pfu polymerase nhằm đảm bảo tính
trung thực của phản ứng nhân bản. Sản phẩm PCR được phân tích bằng điện di trên gel agarose 1.5 %.
Kết quả điện di (hình 5, 6, 7, 8) cho thấy sản phẩm PCR tương ứng với từng gene có kích thước phù hợp với kích thước dự đốn (bảng 4).
Hình 5. Sản phẩm PCR từ các gene E7/HPV 11 (A), E7/HPV 6 (B),
Giếng 1: Chứng âm. Giếng 2: Thang kích thước DNA. Giếng 3: Sản phẩm PCR với mồi đặc hiệu
Hình 6. Sản phẩm PCR từ gene E7 HPV16 với các cặp mồi E7-Nde/E7-Sa (A); E7-Bsa/E7-Sal (B), E7-Nco/E7-Sal (C). Giếng 1: Thang kích thước DNA (1kb). Giếng 2: Chứng âm. Giếng 3:
Sản phẩm PCR thu nhận gene E7 HPV16
Hình 7. Sản phẩm PCR từ gene p16INK4A với cặp mồi p16-Nde/p16-sal (A); cặp mồi p16-
Bsa/p16-sal (B); p16-Nco/p16-sal (C). Giếng 1: Thang kích thước DNA. Giếng 2: Chứng âm.
Giếng 3: Sản phẩm PCR thu nhận gene p16INK4A từ tế bào HeLa
A B C A B C A 3 2 1 500b 250b 500b250b B 1 3 2
33
Hình 8. Sản phẩm PCR từ gene L1 HPV 16 (A) và L1 HPV 18 (B) với cặp mồi L1/18f-Eco/ L1/18r-Xho. Giếng 1: Thang kích thước DNA. Giếng 2: Chứng âm. Giếng 3: Sản phẩm PCR thu
nhận gene L1 HPV18 từ mẫu DNA tách chiết từ dịch phết cổ tử cung. .
Các sản phẩm PCR sau đó được tinh sạch và dịng hóa vào các vector phù hợp.
4.1.2. DỊNG HĨA GENE MỤC TIÊU VÀO VECTOR pET28a(+), pE-SUMO3, pETM-44, pGAT VÀ KIỂM TRA VECTOR TÁI TỔ HỢP BẰNG PCR VÀ GIẢI TRÌNH TỰ
Chúng tơi dịng hóa các gene E7 HPV 6, HPV 11, L1 HPV 16/18 trong vector pET-28a(+). Các gene mà protein được sử dụng cho các nội dung nghiên cứu tiếp theo là
E7 HPV 16 và p16INK4A thì được dịng hóa vào 4 hệ vector là pET-28a(+), pE-SUMO3,
pETM-44, pGAT. Việc sử dụng 4 hệ vector biểu hiện cho phép khảo sát khả năng sử dụng các vector này trong tạo dòng biểu hiện nhiều loại protein khác trong tương lai.
Ký hiệu các vector tái tổ hợp được trình bày trong bảng 5.
Bảng 5. Ký hiệu các vector tái tổ hợp
Vector/Gene E7 HPV 6 E7 HPV 11 E7 HPV 16 p16INK4A L1 HPV16 L1 HPV 18
pET-28a(+) pET-
E7/6
pET- E7/11
pET-E7 pET-p16 pET-L1/16 pET-L1/18
pE-SUMO3 pSUMO-E7 pSUMO-p16
pETM-44 pETM-E7 pETM-p16
pGAT pGAT-E7 pGAT-p16
Các hệ vector trên được chọn vì chúng mang một promoter mạnh (T7 promoter) và mỗi hệ vector có một số ưu điểm riêng được trình bày ở bảng 6.
34
Bảng 6. Đặc điểm của các hệ vector sử dụng dịng hóa gene E7 HPV16 và p16INK4A
Chúng tơi biến nạp các plasmid trên vào tế bào E.coli DH5α và sàng lọc các khuẩn
lạc tái tổ hợp bằng phương pháp PCR khuẩn lạc sử dụng cặp mồi T7 promoter-T7 terminator. Các khuẩn lạc có mang gene mục tiêu được ni, thu sinh khối để tách chiết plasmid. Plasmid tái tổ hợp được kiểm tra bằng PCR với cặp mồi đặc hiệu (bảng 5) và giải trình tự.
Kết quả PCR trên plasmid tái tổ hợp E7 HPV 6, E7 HPV 11 (hình 9), E7HPV 16
(hình 10), p16INK4A (hình 11) cho thấy sự hiện diện của các sản phẩm nhân bản có kích
thước như dự đoán (bảng 4). Đối với hai plasmid tái tổ hợp L1 HPV 16 và L1 HPV 18 sản phẩm PCR khơng đạt được kích thước như mong muốn.
Kết quả so sánh trình tự đoạn chèn từ các plasmid tái tổ hợp với các trình tự trên ngân hàng gene NCBI bằng BLAST (phụ lục 1) cho thấy các plasmid kiểm tra đều mang gene mong muốn. Kết quả sử dụng ClustalX (phụ lục 2) cho thấy ở tất cả các plasmid tái
tổ hợp, các gene E7 HPV 6/11/16 và p16INK4A đã được tạo dòng đồng khung với khung
dịch mã trên plasmid.
Hệ vector Enzyme giới hạn Đuôi dung hợp Ưu điểm pET-28a(+) NdeI và SalI 6xHis - Dễ tinh sạch
- Không cần loại đuôi dung hợp vì đi 6xHis có tính miễn dịch thấp
pGAT NcoI và SmaI 6xHis và GST - Tăng hiệu quả tinh sạch
- Dễ tạo dịng đồng khung nhờ vị trí nhận
biết của NcoI
pE-SUMO3 BsaI và SalI SUMO và 6xHis - Tăng mức độ biểu hiện
- Tăng tính tan của protein tái tổ hợp - Loại bỏ đuôi dung hợp dễ dàng và đặc hiệu
pETM-44 NcoI và SalI 6xHis và MBP - Tăng tính tan của protein tái tổ hợp - Dễ tạo dịng đồng khung nhờ vị trí nhận
biết của NcoI
- “Subcloning” được vào các vector cùng nhóm
35
A B C D
C D
B A
Kết quả BLAST trình tự đoạn chèn trong plasmid tái tổ hợp pET-L1/16 với các trình tự trên NCBI (phụ lục 2) cho thấy plasmid chỉ mang một phần của gene mã hóa L1 với kích thước khoảng 1176 bp, ngắn hơn kích thước dự đốn của L1 HPV 16 (1596 bp) do mất một đoạn 420 bp ở đầu 5’ của gene. Kết quả PCR trên plasmid (hình 12) khẳng định kết quả giải trình tự với kích thước sản phẩm nhân bản ngắn hơn khoảng 420 bp. Chúng tôi thu được kết quả tương tự với gene L1 HPV 18. Do bị mất một đoạn ở đầu 5’ nên không thể xác định được sự đồng khung của trình tự được gắn vào plasmid ; chúng tôi vẫn quyết định tiến hành cảm ứng biểu hiện trên hai plasmid tái tổ hợp này.
Hình 9. Sản phẩm PCR từ các plasmid tái tổ hợp mang gene E7 HPV11 (A) và E7 HPV6 (B);Giếng 1: Thang kích thước DNA . Giếng 2: Chứng âm. Giếng 3: chứng dương. Giếng 4: Sản
phẩm PCR từ plasmid tái tổ hợp.
Hình 10. Sản phẩm PCR từ các plasmid tái tổ hợp mang gene E7 HPV16: pET-E7 (A); pETM-E7(B); pSUMO-E7(C); pGAT-E7 (D).Giếng 1: Thang kích thước DNA . Giếng 2: Chứng pETM-E7(B); pSUMO-E7(C); pGAT-E7 (D).Giếng 1: Thang kích thước DNA . Giếng 2: Chứng
âm. Giếng 3: chứng dương. Giếng 4: Sản phẩm PCR từ plasmid tái tổ hợp.
\
Hình 11. Sản phẩm PCR từ các plasmid tái tổ hợp mang gene p16INK4A: pET-p16 (A);
pETM-p16(B; pSUMO-p16(C); pGAT-p16 (D).Giếng 1: Thang kích thước DNA (1kb). Giếng 2:Chứng âm. Giếng 3: Chứng dương. Giếng 4: Sản phẩm PCR từ plasmid tái tổ hợp.
B 1 2 3 4 500bp 250bp A 2 3 4 1 500bp 250bp
36
Hình 12. Sản phẩm PCR từ các plasmid tái tổ hợp mang gene L1 HPV16 (A) và L1 HPV 18(B). Giếng 1: Thang kích thước DNA (1kb). Giếng 2: Chứng âm. Giếng 3: Chứng dương. Giếng 4, 5, 6: Sản phẩm PCR từ plasmid tái tổ hợp lần lượt với các cặp mồi: mồi xuôi đặc hiệu- mồi ngược đặc hiệu, mồi xuôi đặc hiệu-mồi T7 terminator, mồi T7 promoter-mồi ngược đặc hiệu.
4.1.3. BIỂU HIỆN PROTEIN TÁI TỔ HỢP VÀ KIỂM TRA CHÚNG BẰNG SDS- PAGE VÀ WESTERN BLOT
Chúng tôi biến nạp các plasmid tái tổ hợp vào chủng E.coli BL21 (DE3). Chủng
E.coli BL21 (DE3) mang các plasmid tái tổ hợp được cảm ứng ở 370C trong 6 giờ với 0,5mMIPTG. Kết quả biểu hiện protein tái tổ hợp được kiểm tra bằng phương pháp điện di SDS-PAGE và Western blot với KTĐD kháng protein E7 HPV 16 (hình 13) và p16INK4A (hình 14).
4.1.3.1 Kết quả biểu hiện protein E7 HPV 16
Kết quả điện di SDS-PAGE (hình 13 A1,2,3,4) cho thấy ở chủng BL21 mang các vector tái tổ hợp được cảm ứng (giếng 5) có sự xuất hiện với mức biểu hiện vượt trội của một protein không thấy ở các mẫu mang vector không tái tổ hợp hoặc mang vector tái tổ hợp nhưng không được cảm ứng.
Các protein mục tiêu có kích thước lớn hơn dự đoán đối với protein E7 HPV 16 biểu hiện ở dạng dung hợp với các đi khác nhau theo tính tốn lý thuyết (bảng 7).
Bảng 7. Phân tử lượng dự đốn của protein E7 HPV16 dung hợp với các đi khác nhau.
Hệ vector Dạng dung hợp của protein
E7 HPV16
Kích thước dự đốn
Kích thước trên gel polyacrylamide 12%
pET-28a(+) 6xHis-E7 14 kDa 20 kDa
pETM-44 6xHis-protein MBP-E7 51 kDa 57 kDa
pE-SUMO3 6xHis- protein SUMO –E7 30 kDa 36 kDa
37 A1 B1 A2 B2 A3 B3 B4 A4
Hình 13. Kết quả SDS-PAGE (A ) và Western blot (B) từ các vector pET-E7 (1), pETM-E7 (2), pSUMO-E7 (3), pGAT-E7 (4). Giếng 1: Thang phân tử lượng protein. Giếng 2,3: Protein tổng
của E.coli BL21 (DE3) mang các vector nguyên thủy không được và được cảm ứng.Giếng 4,5: Protein tổng từ E.coli BL21 (DE3) mang các vector tái tổ hợp không được và được cảm ứng: Giếng 6,7: phân đoạn protein thể vùi và thể tan từ chủng BL21mang các vector tái tổ hợp được
cảm ứng.
Sự khác biệt này đã được Moro và cộng sự (1996) ghi nhận. Cơng trình này cho thấy sự di chuyển của một polypeptide trong gel polyacrylamide phụ thuộc vào tương tác giữa nó với các phân tử SDS. Sự hiện diện của các amino acid giàu điện tích âm trong chuỗi polypetide sẽ cản trở tương tác này. Đặc biệt, sự hiện diện của hai amino acid tích điện âm, glutamic acid hay aspartic acid, liền kề nhau sẽ hạn chế sự liên kết giữa SDS và chuỗi polypeptide khiến chuỗi polypeptide di chuyển chậm trong gel. Protein E7 HPV 16 có thành phần glutamic và aspartic acid lần lượt là 9,18 % và 10,2 % và có một vùng, từ amino acid thứ 33 đến amino acid thứ 37, giàu glutamic và aspartic acid. Mặt khác, protein E7 HPV16 cịn có proline với tỉ lệ 6,12 % có khả năng tăng tính bền của cấu trúc protein khiến cho protein càng khó hình thành phức hợp với phân tử SDS.
Kết quả Western blot (hình 13 B1,2,3,4) với kháng thể đặc hiệu cho protein E7 HPV16 cho thấy có vạch tín hiệu lai tương ứng với kết quả điện di SDS-PAGE.
38
4.1.3.2. Kết quả biểu hiện protein p16INK4A
Kết quả phân tích bằng phương pháp SDS-PAGE (hình 14 A1,2,3,4) cho thấy ở
chủng vi khuẩn tái tổ hợp mang gene p16INK4A được cảm ứng (giếng 5) xuất hiện một
vạch protein không thấy ở những mẫu không được cảm ứng hoặc khơng mang vector tái
tổ hợp. Tín hiệu này phù hợp với kích thước dự đốn của protein p16INK4A ở trạng thái
dung hợp với các đi khác nhau được trình bày ở bảng 8.
Kết quả Western blot (hình 14 B1,2,3,4) với kháng thể kháng p16INK4A trên các
vector tái tổ hợp với KTĐD đặc hiệu cho p16INK4A đều cho tín hiệu lai ở vị trí tương ứng
với phân tử lượng của protein p16INK4A ở dạng dung hợp với các đi khác nhau.
Hình 14. Kết quả SDS-PAGE (A) và Western blot (B) từ các vector pET-p16 (1), pETM-p16 (2), pSUMO-p16 (3), pGAT-p16 (4). Giếng 1: Thang phân tử lượng protein. Giếng 2,3: Protein tổng số từ E.coli BL21 (DE3) mang các vector nguyên thủy không được và được cảm ứng.Giếng 4,5: Protein tổng từ E.coli BL21 (DE3) mang các vector tái tổ hợp không được và được cảm ứng.
Giếng 6,7: phân đoạn protein thể vùi và thể tan từ chủng BL21mang các vector tái tổ hợp được cảm ứng.
A1 B1
A2 B2
A3 B3
39
Bảng 8. Kích thước dự đốn của protein p16INK4A ở dạng dung hợp với các đuôi khác nhau
Hệ vector Trạng thái dung hợp của protein p16INK4A Kích thước dự đốn
pET28a(+) 6xHis-p16INK4A 18,7 kDa
pETM44 6xHis-protein MBP-p16INK4A 57 kDa
pSUMO3 6xHis- protein SUMO -p16INK4A 34 kDa
pGAT 6xHis- protein GST -p16INK4A 43 kDa
Kết quả SDS-PAGE và Western blot (hình 14) cho thấy chúng tôi đã biểu hiện
thành công protein E7 HPV16 và p16INK4A tái tổ hợp ở dạng dung hợp với các đuôi 6xHis
(pET28a(+)), 6xHis-MBP (pETM-44), 6xHis-SUMO (pSUMO3), 6xHis-GST (pGAT).
4.1.3.3. Kết quả biểu hiện protein E7 HPV 6 và E7 HPV 11
Kết quả điện di SDS-PAGE và Western blot với kháng thể kháng His (đối với E7 HPV 6) (hình 15 A, B) và kháng thể đặc hiệu (E7 HPV 11) (hình 15 C, D) cho thấy ở các chủng BL21 có mang gene E7 HPV 6 và E7 HPV 11 được cảm ứng (giếng 5) có sự xuất hiện với mức biểu hiện vượt trội của một protein không thấy ở các mẫu mang vector không tái tổ hợp hoặc mang vector tái tổ hợp nhưng khơng được cảm ứng. Kích thước của protein trong hai trường hợp phù hợp với kết quả dự đốn lý thuyết là 16 kDa.
Hình 15. Kết quả SDS-PAGE (A) và Western blot (B) từ các vector pET-E7/6 (1), pET-E7/11 (2), Giếng 1: Thang phân tử lượng protein. Giếng 2,3: Protein tổng số từ E. coli BL21 (DE3) mang các vector nguyên thủy không được và được cảm ứng. Giếng 4,5: Protein tổng từ E. coli
BL21 (DE3) mang các vector tái tổ hợp không được và được cảm ứng. Giếng 6,7: phân đoạn protein thể vùi và thể tan từ chủng BL21mang các vector tái tổ hợp được cảm ứng.