PHẦN 4 KẾT QUẢ
4.5. XÂY DỰNG QUY TRÌNH IMMUNOPCR
4.5.6. KHẢO SÁT NỒNG ĐỘ STREPTAVIDIN (STV)
Chúng tôi khảo sát nồng độ streptavidin nhằm giảm lượng streptavidin, là thành phần làm tăng chi phí của phản ứng, xuống mức tối thiểu mà vẫn duy trì được tín hiệu đặc hiệu. Chúng tơi pha lỗng bậc 2 STV từ 10 µg/ml xuống để tìm ra giá trị nồng độ bão hịa tín hiệu. Tuy nhiên, kết quả (hình 53) cho thấy càng pha lỗng STV, tín hiệu càng giảm. Do đó, chúng tơi chọn 10 µg/ml STV làm nồng độ sử dụng cho phản ứng immunoPCR.
Hình 53. Sản phẩm PCR với các nồng độ streptavidin. 1-8: E7HPV18: 2,5 µg/ml; 1-7:
streptavidin pha lỗng bậc 2 từ 10 µg/ml ; 8: 0 µg/ml streptavidin. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 - +
74
4.5.7. TÁC NHÂN “KHĨA” GIẾNG VÀ SỐ CHU KÌ PCR
Chúng tơi khảo sát các nồng độ khác nhau của tác nhân “khóa” giếng là DNA tinh trùng cá hồi (0,1 mg/ml, 0,2 mg/ml, 0,4 mg/ml, 0,6 mg/ml, 0,8 mg/ml, 1 mg/ml) bổ sung vào dung dịch “khóa” giếng là sữa gầy 5 % để làm giảm tín hiệu nền của phản ứng.
Đồng thời, chúng tơi khảo sát số chu kì PCR, trong khoảng 30 đến 40 chu kì, để làm tăng độ nhạy của quy trình mà khơng làm gia tăng tín hiệu nền.
Hình 54. Sản phẩm PCR với các tác nhân khóa giếng và số chu kì PCR khác nhau. 1-6 : Sữa gầy 5 % bổ sung DNA tinh trùng cá hồi với nồng độ từ 0,1 mg/ml, 0,2 mg/ml, 0,4 mg/ml, 0.6 gầy 5 % bổ sung DNA tinh trùng cá hồi với nồng độ từ 0,1 mg/ml, 0,2 mg/ml, 0,4 mg/ml, 0.6
mg/ml, 0,8 mg/ml, 1 mg/ml. a : PCR 30 chu kì, b : PCR 40 chu kì. a, b : 0 µg/ml E7 HPV 18
Kết quả (hình 54) cho thấy khơng có sự khác biệt về tín hiệu nền khi tăng nồng độ DNA tinh trùng cá hồi. Nên chúng tôi quyết định sử dụng nồng độ thấp nhất là 0,1 mg/ml để bổ sung vào dung dịch “khóa” giếng. Khi tăng từ 30 chu kì PCR lên 40 chu kì, tín hiệu nền tăng mạnh. Do đó, chúng tơi sử dụng PCR 30 chu kì cho quy trình immunoPCR.
Tóm lại, các thơng số của quy trình immunoPCR được xác định bao gồm :
Nồng độ các kháng thể sử dụng cho quy trình là :
- 20 µg/ml đối với kháng thể 1D5 phủ giếng - 5 µg/ml KTĐD phát hiện 4H5-biotin
- 10 µg/ml streptavidin và 25 pg/ml DNA đánh dấu biotin
Tác nhân block giếng là sữa gầy 5 %, bổ sung 0,1 mg/ml DNA tinh trùng cá hồi Số chu kì PCR là 30.
75
4.6. XÂY DỰNG QUY TRÌNH HĨA TẾ BÀO MIỄN DỊCH
Chúng tôi khảo sát một số thông số quan trọng và dựa vào các thơng số đã tối ưu hóa để xây dựng quy trình. Các thơng số khảo sát bao gồm : nồng độ KTĐD, tác nhân cố định tế bào trên lam kính, tác nhân bộc lộ kháng ngun.
Các bước chính của quy trình hóa tế bào miễn dịch được khái quát qua lưu đồ sau :
4.6.1. NỒNG ĐỘ KHÁNG THỂ TỐI ƯU CHO QUY TRÌNH LAI TRÊN LAMELLE
Trước tiên, chúng tôi khảo sát nồng độ tối ưu của các KTĐD 1D5 phát hiện protein
E7 HPV 18, 2C1 phát hiện protein E7 HPV 16 và 1C10 phát hiện protein p16INK4A ở các
dịng tế bào ni cấy chủ động trên lamelle. Các kết quả này sẽ là cơ sở để để xây dựng quy trình nhuộm hóa tế bào miễn dịch với tế bào cổ tử cung cố định trên lame kính.
Với KTĐD 1D5, chúng tơi sử dụng tế bào HeLa, là dịng tế bào biểu hiện tự nhiên protein E7 HPV 18, để xác định nồng độ kháng thể tối ưu cho quy trình. Chúng tơi khảo sát ba nồng độ kháng thể là 2,5 µg/ml, 5 µg/ml và 10 µg/ml. Dịng tế bào C-33 A, là dòng tế bào UTCTC nhưng không biểu hiện protein E7, được sử dụng làm tế bào chứng âm.
Thu tế bào qua ly tâm, trải và cố định tế bào lên lam kính Thu mẫu tế bào cổ tử cung và giữ trong dung dịch bảo quản
Bộc lộ kháng nguyên
Khóa peroxidase nội sinh
Lai với kháng thể sơ cấp
Lai với kháng thể thứ cấp
Phát hiện bằng cơ chất, nhuộm tương phản, quan sát kết quả
Khảo sát tác nhân cố định tế bào trên lam kính
Khảo sát tác nhân bộc lộ kháng nguyên
Khảo sát nồng độ kháng thể sơ cấp
76
Hình 55. Nhuộm hóa tế bào miễn dịch sử dụng KTĐD kháng E7 HPV 18 - 1D5 trên dòng tế bào HeLa và C-33 A với các nồng độ kháng thể 10 µg/ml, 5 µg/ml và 2,5 µg/ml
Kết quả (hình 55) cho thấy tín hiệu dương tính quan sát được rõ nhất ở nồng độ 10 µg/ml trên tế bào HeLa ; tế bào C-33 A cho tín hiệu nền yếu ở cả ba nồng độ KTĐD khảo sát. Chúng tơi chọn nồng độ 10 µg/ml là nồng độ sử dụng cho kháng thể 1D5.
Hình 56. Nhuộm hóa tế bào miễn dịch sử dụng KTĐD kháng E7 HPV 16 – 2C1 trên dòng tế bào CaSki và C-33 A với các nồng độ kháng thể 20 µg/ml, 10 µg/ml, 5 µg/ml và 2,5 µg/ml
77
Hình 57. Nhuộm hóa tế bào miễn dịch sử dụng KTĐD kháng p16INK4A – 1C10 trên dòng tế
bào HeLa và MCF-7 với các nồng độ kháng thể 20 µg/ml, 10 µg/ml, 5 µg/ml và 2,5 µg/ml
Tương tự, với KTĐD 2C1, chúng tôi sử dụng tế bào CaSki là dòng tế bào biểu hiện tự nhiên protein E7 HPV 16 và dòng tế bào C-33 A là chứng âm. Với KTĐD 1C10,
chúng tơi sử dụng tế bào HeLa là dịng tế bào biểu hiện tự nhiên protein p16INK4A và dòng
tế bào MCF-7 là chứng âm. Chúng tôi khảo sát 3 nồng độ kháng thể là 2,5 µg/ml, 5 µg/ml, 10 µg/ml và 20 µg/ml đối với cả 2 kháng thể. Kết quả với KTĐD 2C1 (hình 56) cho thấy tín hiệu dương tính rõ trên CaSki và khơng có tín hiệu nền trên C-33 A là ở nồng độ 5 µg/ml. Trong khi đó, KTĐD 1C10 cho kết quả nồng độ tối ưu ở 10 µg/ml (hình 57).
Chúng tơi nhuộm hóa tế bào miễn dịch với nhiều nồng độ kháng thể trên nhiều dòng tế bào như HeLa, CaSki, C-33 A, MCF-7, CHO-K1 chuyển gene E7 HPV 18 và CHO-K1 khơng chuyển gene để kiểm tra tính đặc hiệu của các KTĐD ở nồng độ sử dụng.
Hình 58. Nhuộm hóa tế bào miễn dịch với KTĐD 1D5 (10 µg/ml) trên tế bào HeLa, C-33 A, CHO-K1 chuyển vector pEGFP-E7HPV18, CHO-K1 chuyển vector pEGFP-C2, CaSki
78
KTĐD 1D5 (10 µg/ml) cho tín hiệu dương tính với tế bào HeLa là CHO-K1 chuyển gene E7 HPV18, có tín hiệu rất mờ ở dòng tế bào CaSki và C-33 A (hình 58). KTĐD 2C1 (5 µg/ml) chỉ cho tín hiệu dương tính với CaSki mà khơng có tín hiệu nền với các dịng tế bào khơng biểu hiện E7 HPV 16 khác (hình 59). KTĐD 1C10 (10 µg/ml) cho
tín hiệu dương tính rõ trên các dịng tế bào có biểu hiện p16INK4A gồm HeLa, CaSki và C-
33 A, khơng có tín hiệu nền trên dịng chứng âm MCF-7 (hình 60).
Hình 59. Nhuộm hóa tế bào miễn dịch sử dụng kháng thể 2C1 (5 µg/ml) trên các dịng tế bào HeLa, Caski, C-33 A, MCF-7
Hình 60. Nhuộm hóa tế bào miễn dịch sử dụng kháng thể 1C10 (10 µg/ml) trên các dịng tế bào HeLa, Caski, C-33 A, MCF-7
79
Như vậy, ở các nồng độ sử dụng, KTĐD 1D5 (10 µg/ml), 2C1 (5 µg/ml) và KTĐD 1C10 (10 µg/ml) cho tín hiệu dương tính đặc hiệu với các dịng tế bào chuyển gene và tế bào biểu hiện tự nhiên protein mục tiêu.
Sau khi xác định điều kiện lai hóa tế bào miễn dịch trên lamelle làm cơ sở cho nội dung tiếp theo, chúng tôi tiếp tục khảo sát các điều kiện thực nghiệm cho quy trình lai hóa tế bào miễn dịch với tế bào nuôi cấy và cố định trên lame kính nhằm áp dụng vào bệnh phẩm là tế bào cổ tử cung
Các điều kiện khảo sát bao gồm : tác nhân cố định tế bào, nồng độ KTĐD, công đoạn bộc lộ kháng nguyên (tác nhân, thời gian, phương thức). Cuối cùng, chúng tơi khảo sát tính đặc hiệu của phương pháp lai hóa tế bào miễn dịch với các KTĐD trong những điều kiện đã xác định.
4.6.2. TÁC NHÂN CỐ ĐỊNH TẾ BÀO TRONG QUY TRÌNH LAI TRÊN LAME KÍNH
Chúng tơi khảo sát tác nhân dùng cố định và bảo quản tế bào trong quy trình nhuộm hóa miễn dịch trên lame kính, sử dụng tế bào HeLa và KTĐD 1C10. Các tác nhân khảo sát bao gồm : paraformaldehyde (PFA) 1 %, ethanol 30 %, methanol 30 %, acetone 10 %. Dung dịch PFA 1 % cho phép duy trì hình dạng của tế bào lâu dài, khơng gây đơng máu, cho tín hiệu lai dương tính rõ nhất so với các tác nhân cịn lại (hình 61).
Vì vậy chúng tơi chọn PFA 1 % làm tác nhân cố định và bảo quản tế bào mẫu dịch phết cho quy trình.
Hình 61. Các tác nhân sử dụng trong cố định và bảo quản tế bào : PFA 1 %, ethanol 30 %, methanol 30 % và acetone 10 %
80
4.6.3. NỒNG ĐỘ KHÁNG THỂ TRONG QUY TRÌNH LAI TRÊN LAME KÍNH
Khi áp dụng nồng độ KTĐD tối ưu cho quy trình lai trên lamelle vào thử nghiệm lai với tế bào cố định trên lame kính, kết quả khơng như mong muốn. Điều này có thể là do sự khác biệt ở nhiều bước giữa hai quy trình. Vì vậy, chúng tơi phải xác định lại nồng độ KTĐD thích hợp cho quy trình lai trên lame kính.
KTĐD 1D5 ở nồng độ 20 µg/ml cho tín hiệu khơng đặc hiệu trên tế bào C-33 A, trong khi ở nồng độ 10 µg/ml tín hiệu đặc hiệu khơng giảm mà tín hiệu khơng đặc hiệu mờ đi đáng kể nên chúng tôi chọn nồng độ 10 µg/ml cho KTĐD 1D5 (hình 62).
Hình 62. Nhuộm hóa tế bào miễn dịch trên lame kính sử dụng KTĐD 1D5 trên dòng tế bào HeLa và C-33 A với các nồng độ kháng thể 20 µg/ml, 10 µg/ml, 5 µg/ml và 2,5 µg/ml
KTĐD 2C1 cho tín hiệu dương tính trên CaSki yếu dần từ nồng độ 10 µg/mltrong khi tín hiệu khơng đặc hiệu lại rõ ở tất cả các nồng độ (hình 63), nên chúng tơi chọn 20 µg/ml là nồng độ sử dụng cho 2C1. Việc giảm tín hiệu khơng đặc hiệu sẽ được trình bày ở nội dung sau.
Hình 63. Nhuộm hóa tế bào miễn dịch trên lame kính với KTĐD 2C1 trên dòng tế bào CaSki và C-33 A với các nồng độ kháng thể 80 µg/ml, 40 µg/ml, 20 µg/ml và 10 µg/ml
81
KTĐD 1C10 cho tín hiệu đặc hiệu mạnh nhất ở nồng độ 80 µg/ml và khơng có tín hiệu nền nào trên dòng chứng âm MCF-7, nên chúng tơi chọn 80 µg/ml là nồng độ sử dụng của KTĐD 1C10 (hình 64).
Hình 64. Nhuộm hóa tế bào miễn dịch trên lame kính với KTĐD 1C10 trên dịng tế bào HeLa và MCF-7 với các nồng độ kháng thể 80 µg/ml, 40 µg/ml, 20 µg/ml và 10 µg/ml
4.6.4. CÁC ĐIỀU KIỆN BỘC LỘ KHÁNG NGUYÊN TRONG QUY TRÌNH LAI TRÊN LAME KÍNH TRÊN LAME KÍNH
Bộc lộ kháng nguyên là một bước quan trọng giúp khôi phục lại các epitope đã bị thay đổi trong giai đoạn cố định bằng PFA, ethanol hay methanol. Trước tiên, chúng tôi khảo sátba tác nhân là citrate 10 mM pH 6, citrate 10 mM - EDTA 1 mM pH 6 và Tris 10 mM – EDTA 1 mM pH 9.
Hình 65. Nhuộm hóa tế bào miễn dịch trên dòng tế bào HeLa và C-33 A với kháng thể 1D5 (10 µg/ml), tác nhân bộc lộ kháng nguyên là citrate 10 mM/EDTA 1 mM pH 6,Tris 10 mM/
82
Kết quả cho thấy KTĐD 1D5 và 1C10 hoạt động tốt nhất với dung dịch Tris- EDTA pH 9 (hình 65 và 67). KTĐD 2C1 hoạt động tốt ở cả hai dung dịch citrate-EDTA pH6 và Tris-EDTA pH 9 (hình 66). Vì vậy để tiện sử dụng, chúng tôi chọn dung dịch Tris-EDTA pH 9 làm dung dịch bộc lộ kháng nguyên cho quy trình.
Hình 66. Nhuộm hóa tế bào miễn dịch trên dịng tế bào CaSki và C-33 A với kháng thể 2C1 (20 µg/ml), sử dụng tác nhân bộc lộ kháng nguyên là citrate 10 mM/EDTA 1 mM pH 6,Tris 10
mM/ EDTA 1mM pH 9 và citrate 10 mM pH 6
Hình 67. Nhuộm hóa tế bào miễn dịch trên dịng tế bào HeLa và MCF-7 với kháng thể 1C10 (80 µg/ml), sử dụng tác nhân bộc lộ kháng nguyên là citrate 10 mM/EDTA 1 mM pH 6,Tris 10
mM/ EDTA 1mM pH 9 và citrate 10 mM pH 6
Tiếp theo, chúng tôi khảo sát thời gian và phương thức bộc lộ kháng nguyên : sử
dụng bể ổn nhiệt 950C hoặc lị vi sóng. Đối tượng khảo sát là KTĐD 1C10 trên tế bào
HeLa. Kết quả cho thấy (hình 68), bộc lộ kháng nguyên với tác nhân là Tris-EDTA pH 9 trong bể ổn nhiệt 20 phút và bằng lị vi sóng 10 phút có hiệu quả tương đương nhau. Như vậy, tùy theo tình hình thực tiễn có thể sử dụng một trong hai phương pháp để bộc lộ kháng nguyên.
83
Hình 68. Nhuộm hóa tế bào miễn dịch trên dịng tế bào HeLa với kháng thể 1C10 (80 µg/ml), sử dụng tác nhân bộc lộ kháng nguyên là Tris 10 mM/ EDTA 1mM pH 9 theo 2 phương pháp
là đun trong bể ổn nhiệt và microwave, ở 2 thời gian xử lý là 10 phút và 20 phút
Như vậy, các thơng số tối ưu cho quy trình hóa miễn dịch tế bào là : tác nhân cố định tế bào PFA 1 %, nồng độ KTĐD là 10µg/ml cho 1D5, 20 µg/ml cho 2C1 và 80 µg/ml cho 1C10, dung dịch Tris-EDTA pH 9 trong bể ổn nhiệt 20 phút hoặc lị vi sóng 10 phút để bộc lộ kháng nguyên.
4.6.5. KHẢO SÁT ĐỘ ĐẶC HIỆU CỦA QUY TRÌNH LAI TRÊN LAME KÍNH
Các thơng số tối ưu của quy trình được áp dụng để khảo sát độ đặc hiệu của quy trình trên các dịng tế bào chứng dương và chứng âm khác nhau.
Hình 69. Nhuộm hóa tế bào miễn dịch trên dịng tế bào HeLa, CaSki, C-33 A và MCF-7 với KTĐD 1D5(10 µg/ml)
84
Hình 70. Nhuộm hóa tế bào miễn dịch trên dịng tế bào HeLa, CaSki, C-33 A và MCF-7 với KTĐD 2C1 (20 µg/ml)
Hình 71. Nhuộm hóa tế bào miễn dịch trên dòng tế bào HeLa, CaSki, C-33 A và MCF-7 với KTĐD 1C10 (80 µg/ml)
Kết quả cho thấy KTĐD 1D5 cho tín hiệu đặc hiệu mạnh trên HeLa, phản ứng chéo trên tế bào CaSki và MCF-7 (hình 69). KTĐD 2C1 cho phản ứng chéo yếu trên HeLa và MCF-7 (hình 70). KTĐD 1C10 cho tín hiệu đặc hiệu mạnh trên cả 3 dòng tế bào chứng dương HeLa, CaSki và C-33 A, không cho phản ứng chéo với tế bào chứng âm MCF-7 (hình 71).
Chúng tơi áp dụng các thông số đã xác định để phát hiện các protein mục tiêu trong mẫu tế bào ung thư cổ tử cung.
85
4.6.6. KHẢO SÁT CÁC ĐIỀU KIỆN ỔN ĐỊNH KTĐD 1C10
Để duy trì hiệu quả hoạt động của KTĐD đặc hiệu, chúng tơi khảo sát một số hóa chất được xem như có khả năng ổn định kháng thể như trehalose, sucrose và glycerol. Trehalose, sucrose và glycerol là ba chất thông dụng được sử dụng để ổn định cấu trúc và hoạt tính của protein. Nồng độ trehalose, sucrose thường được sử dụng từ 0,1 M đến 0,3 M trong các chất bảo quản protein (Schiffter, 2011 ; Wang & cs, 2007). Glycerol thường được sử dụng trong khoảng nồng độ 25 % - 50 % (Vagenende & cs, 2009 ; Wang & cs, 2007). Do đó, chúng tối chọn nồng độ khảo sát là 0,1 M, 0,25 M, 0,5 M đối với trehalose, và sucrose. Đối với glycerol, các nồng độ khảo sát là 10 %, 25 %, 50 %.
Các dung dịch ổn định kháng thể được sử dụng có các thành phần như sau:
- Dung dịch 1, 2, 3 : có thành phần chung là TBS 1X, sodium nazide 0,05%, BSA 0,5% pH 7,4, cộng thêm với các nồng độ khác nhau của trehalose lần lượt là 0,1 M, 0,25 M và 0,5 M.
- Dung dịch 4, 5, 6 : có thành phần chung giống như trên cộng thêm với các nồng độ sucrose khác nhau lần lượt là 0,1M, 0,25 M và 0,5 M.
- Dung dịch 7, 8, 9 : có thành phần chung giống như trên cộng thêm với các nồng độ glycerol khác nhau lần lượt là 10 %, 24 % và 50 %.
- Dung dịch 10 : chỉ bao gồm các thành phần chung như trên.
- Dung dịch 11 : bao gồm các thành phần chung như trên nhưng thiếu BSA.
Như vậy, dung dịch 11 khơng chứa hóa chất ổn định nào, cịn dung dịch 10 chỉ có BSA là hóa chất ổn định protein thơng dụng.
Thí nghiệm được tiến hành như sau :
KTĐD 1C10 được bảo quản trong 11 ống chứa các dung dịch như trên. Ở các thời điểm 0 ngày, 30 ngày, 60 ngày, 90 ngày, 120 ngày, 150 ngày, tiến hành nhuộm miễn dịch tế bào HeLa và MCF-7 với 11 ống dung dịch kháng thể nêu trên.
Tín hiệu dương tính với protein p16INK4A là tín hiệu màu nâu trong nhân và tế bào
87
Hình 72. Kết quả nhuộm miễn dịch với KTĐD 1C10 tế bào HeLa và tế bào MCF-7 (chứng