Kí hiệu vector Kích thước sản phẩm dự đốn (bp)
pET-E7 598 pETM-E7 1659 pSUMO-E7 826 pGAT-E7 945 pET-p16INK4A 772 pETM-p16INK4A 1833 pSUMO-p16INK4A 1000 pGAT-p16INK4A 1119
20
Tiếp theo, những khuẩn lạc cho sản phẩm PCR dương tính phù hợp với kích thước dự đốn (bảng 2) được chọn để nuôi cấy và tách chiết plasmid. Plasmid tách chiết sau đóđược kiểm tra bằng phương pháp PCR với các cặp mồi đặc hiệu cho từng gene. Thành phần phản ứng PCR tương tự như trên, trong đó bản mẫu là 1 µl DNA plasmid, 0,5 µl mồi đặc hiệu.
3.2.7. Phương pháp thu nhận – tinh sạch protein tái tổ hợp
Các plasmid tái tổ hợp mang gene mong muốn được biến nạp vào chủng vi khuẩn
E. coli BL21(DE3)pLysS.
Vi khuẩn được nuôi cấy trong5 mlmôi trường LB bổ sung kanamycin (30 µg/ml) hoặc ampicillin (100 µg/ml) ở 37°C, vận tốc lắc 250 vịng/phút. Bổ sung 25 µl IPTG (0,5 mM) khi dịch nuôi cấy đạt giá trị OD600 trong khoảng 0,6-1. Sau khi cảm ứng 4 giờ, sinh khối vi khuẩn được thu nhận qua ly tâm (5000 vòng/phút - 5 phút). Huyền phù sinh khối trong 250 µl dung dịch ly giải (NaCl 50 mM, EDTA 1 mM pH 8). Tế bào vi khuẩn trong dịch huyền phù được phá vỡ bằng sóng siêu âm. Các phân đoạn được thu nhận qua ly tâm 13000 vòng - 30 phút - 4°C. Phần dịch nổi là phân đoạn protein biểu hiện ở pha tan trong tế bào chất được chuyển qua một eppendorf mới ; phần cặn là phân đoạn protein ở dạng thể vùi được hịa vào 250 µl dung dịch NaCl 50 mM, EDTA 1 mM pH 8.
Sau đó các phân đoạn được phân tích bằng phương pháp SDS-PAGE. Thu nhận lượng lớn protein tái tổ hợp và tinh sạch
Cảm ứng 1 l dịch nuôi cấy vi khuẩn khi dịch nuôi cấy đạt được giá trị OD600 bằng 0,8 với IPTG 0,5 mM ở 37°C. Ly tâm thu sinh khối vi khuẩn sau 6 giờ cảm ứng ở 5000 vòng/phút trong 5 phút. Huyền phù sinh khối trong 200 ml dung dịch gắn cột, bổ sung vào 1 ml lysozyme 10 mg/ml, ủ 1 giờ ở nhiệt độ phịng. Phá màng tế bào bằng sóng siêu âm ở điều kiện lạnh trên nước đá trong 10 giây, nghỉ 10 giây, lặp lại nhiều lần trong tổng thời gian là 1 giờ 30 phút. Ly tâm ở 13.000 vòng/phút trong 30 phút ở 4°C, thu phần dịch đồng nhất ở phía trên. Cân bằng cột His-trap FF crude (Amersham) bằng 5 ml dung dịch gắn cột (3.1.6.1). Nạp cột với 200 ml dịch đồng nhất thu được. Rửa cột bằng 20 ml dung dịch rửa cột (3.1.6.1). Dung ly bằng 5 ml dung dịch dung ly (3.1.6.1), thu dịch dung ly thành các phân đoạn 1 ml.
3.2.8. Phương pháp điện di SDS-PAGE
Trộn 40 µl dịch ly giải protein (3.1.6.1) với 10 µl dung dịch nạp mẫu 5X (3.1.6.1). Mẫu được đun ở 100°C - 10 phút, làm lạnh nhanh trong đá đang tan. Chuẩn bị gel
21
polyacrylamide có nồng độ acrylamide là 12 %. Nạp mẫu (10 µl/giếng) với 10 µl thang điện di protein. Điện di ở 100 V trong 2 giờ. Nhuộm (3.1.6.1) 30 phút, giải nhuộm.
3.2.9. Phương pháp Western blot
Sau điện di SDS-PAGE, phần gel phân tách được ngâm trong dung dịch điện chuyển (mục 1.6.1) trong 30 phút. Màng lai cắt góc và giấy thấm được ngâm trong nước cất 5 phút, rồi trong dung dịch chuyển màng ít nhất 15 phút. Tiến hành chuyển thẩm ở 110 V - 1 giờ 30 phút. Cho màng lai vào dung dịch khóa màng (3.1.6.1), ủ 40°C qua đêm. Tiếp tục ủ màng ở 4°C qua đêm với kháng thể sơ cấp (KTĐD kháng đặc hiệu các protein nghiên cứu) được pha loãng với tỉ lệ 1:1000 trong dung dịch khóa màng. Sau đó, rửa màng 4 lần bằng dung dịch TBST, mỗi lần 15 phút. Ủ màng với kháng thể thứ cấp kháng IgG chuột có đánh dấu HRP (horseradish peroxidase) ở nhiệt độ phịng trong 90 phút. Sau đó, rửa màng 6 lần bằng dung dịch TBST, mỗi lần rửa 15 phút. Màng lai được ủ với 1 ml dung dịch cơ chất của HRP (3.1.6.1) trong 5 phút. Ghi nhận tín hiệu bằng hệ thống thu hình Gel Doc - Biorad.
3.2.10. Phương pháp Bradford
Dựng đường chuẩn với dãy nồng độ dung dịch BSA (2 mg/ml) được tạo như sau :
µg/ml 0 25 50 75 100 125 150
BSA (µl) 0 12,5 25 37,5 50 62,5 75
PBS (µl) 1000 987,5 975 962,5 950 937,5 925
Để định lượng protein trong mẫu, cho vào mỗi giếng 160 µl dung dịch Bradford 1X. Bổ sung 40 µl mẫu vào mỗi giếng. Lắc 3 phút trên máy ELISA reader. Đo OD ở bước sóng 595 nm.
3.2.11. Phương pháp tạo KTĐD
Phương pháp bao gồm 4 bước : (1) gây đáp ứng miễn dịch chuột, (2) dung hợp tạo tế bào lai và chọn lọc dòng hybridoma sản xuất kháng thể mong muốn, (3) sản xuất và tinh sạch KTĐD, (4) kiểm tra một số đặc tính của KTĐD.
3.2.11.1. Gây đáp ứng miễn dịch trên chuột
Các protein tái tổ hợp E7 HPV16 và p16INK4A sau khi tinh sạch được sử dụng để
gây đáp ứng miễn dịch cho 3 chuột cái BALB/c 8 tuần tuổi (bảng 3).
Khả năng đáp ứng miễn dịch của chuột được đánh giá bằng phương pháp ELISA trực tiếp sử dụng protein tái tổ hợp làm kháng nguyên phủ giếng.
22