3. đỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.4.6.Phương pháp xác ựịnh một số yếu tố gây bệnh
Phương pháp xác ựịnh một số yếu tố gây bệnh (gồm ựộc tố ựường ruột (Stn), yếu tố xâm nhập (InvA) và gen kháng kháng sinh DT104) của các chủng Salmonella bằng phương pháp PCR
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ...47
* Tách DNA:
Các chủng vi khuẩn cần kiểm tra ựược nuôi cấy trên môi trường thạch máu ở 37oC trong 24 giờ. Lấy 1 Ờ 2 khuẩn lạc hòa vào 300 ộl nước khử Ion vô trùng. đun cách thủy ở 100oC trong 15 phút, ly tâm 10.000 vòng/phút trong 10 phút. Hút phần dịch nổi có chứa DNA ựể làm phản ứng PCR.
* Primer (mồi): Bảng 3.2. Trình tự các cặp mồi và kắch cỡ sản phẩm Ký hiệu mồi Trình tự mồi Sản phẩm (bp) Stn- F Stn- R 5Ỗ- CTTTGGTCGTAAATAAGGCG- 3Ỗ 5Ỗ- TGCCCAAAGCAGAGAGATTC- 3Ỗ 259 InvA- F InvA- R 5Ỗ- TTGTTACGGCTATTTTGACCA- 3Ỗ 5Ỗ- CTGACTGCTACCTTGCTGATG- 3Ỗ 521 104SR- F 104SR-R 5Ỗ- GTCAGCAGTGTATGGAGCGA- 3Ỗ 5Ỗ- AGTAGCGCCAGGACTCGTTA- 3Ỗ 162 Trình tự các các cặp mồi và kắch thước các sản phẩm PCR dùng ựể xác ựịnh ựộc tố ựường ruột (Stn), yếu tố xâm nhập (InvA) và gen kháng kháng sinh DT104 (Definitive Phage Type 104) của Salmonella dựa trên các nghiên cứu ựã ựược công bố của các tác giả: Suzuki và cs (1994) [73]; Pritchett và cs (2000) [65]; Saitoh và cs (2005) [68]; Cortez và cs (2006) [39]; Skyberg và cs (2006) [70].
* Hỗn hợp phản ứng PCR bao gồm các thành phần:
- 5ộl PCR buffer 5x [(750mM Tris-HCl (pH 8.8), 200mM (NH4)2SO4, 0,1% Tween 20) (ABgene), 2mM MgCl2,200ộM của mỗi loại dNTP.
- 1 ộl mỗi loại primer (3,2 ộM /ộl).
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ...48
- Nước cất vừa ựủ 25 ộl cho một phản ứng.
Tiến hành phản ứng trong máy PCR theo các giai ựoạn: Tiền biến ở 94oC/ 5 phút và 30 chu kỳ nhiệt (biến tắnh 94oC/1 phút, ủ bắt cặp mồi 50oC/1 phút, kéo dài 72oC/1 phút), và kéo dài cuối cùng ở 72oC/ 7 phút.
* Chạy ựiện di:
Sản phẩm PCR thu ựược sau chu trình phản ứng ựược nhuộm với chất nhuộm nhỏ mẫu (Loading dye), trộn vào mẫu theo tỉ lệ 1:5. Sau khi nhuộm, sản phẩm PCR ựược chạy ựiện di trên Gel Agarose 2% trong dung dịch ựệm TAE (Tris- Acetate- EDTA) với hiệu ựiện thế 100V trong 30 phút.
*Nhuộm:
Gel sau khi chạy ựiện di ựược nhuộm bằng chất nhuộm màu huỳnh quang Ethidium Bromide (1 ộl/ml) trong vòng 15 phút.
* đọc kết quả:
đọc kết quả bằng cách quan sát dưới ựèn UV (300 nm) và chụp ảnh bằng hệ thống Gel Doc. Kắch thước các băng DNA ựược so với DNA chuẩn (DNA marker).