Chương 1 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.3. Tác nhân gây bệnh và các phương pháp xét nghiệm chẩn đoán
1.3.3. Các kỹ thuật sinh học phân tử chẩn đốn bệnh sốt mị
Các xét nghiệm huyết thanh học để phát hiện kháng thể Orientia tsutsugamushi không phù hợp để chẩn đốn bệnh trong giai đoạn cấp vì nồng
độ kháng thể có thể dưới ngưỡng phát hiện trong giai đoạn bệnh khởi phát. Do đó, việc phát hiện kháng nguyên/mầm bệnh trước khi nồng độ kháng thể đặc hiệu tăng lên là rất quan trọng. Phương pháp sinh học phân tử được sử dụng để chẩn đốn bệnh sốt mị là phát hiện ADN của Orientia tsutsugamushi. Hầu hết các xét nghiệm phát hiện kháng nguyên/mầm bệnh
hiện nay dựa vào phương pháp PCR, realtime PCR định lượng hay nested PCR nhắm vào các gen đích khác nhau, bao gồm 56 kDa, 47 kDa, groEL của
Orientia tsutsugamushi [47], [74], [94]. Có nghiên cứu đã chỉ ra rằng xét nghiệm PCR lồng có thể nhạy hơn so với các xét nghiệm huyết thanh gồm cả xét nghiệm IFA được coi là tiêu chuẩn tham chiếu. Phương pháp sinh học phân tử này có thể phát hiện ADN Orientia tsutsugamushi trong máu ngay cả trong giai đoạn mới nhiễm bệnh, khi chưa có triệu chứng lâm sàng rõ ràng nhưng độ nhạy của PCR giảm khi bệnh nhân được điều trị [41], [51], [130].
Tuy nhiên, tất cả các xét nghiệm này đòi hỏi phải đào tạo để vận hành máy luân nhiệt PCR, và trong điều kiện với nguồn lực hạn chế thì việc trang bị, bảo dưỡng, căn chỉnh máy luân nhiệt đảm bảo hoạt động ổn định là rất
khó khăn. Bên cạnh đó, trong nghiên cứu của Đồn Trọng Tuyên và cộng sự (2008-2010) [34], việc thiết kế mồi trên đoạn gene 56 kDa và groEL cho các phản ứng Nested-PCR và Duplex-PCR để phát hiện Orientia tsutsugamushi cho kết quả phát hiện chưa cao, có thể do độ nhạy và đặc hiệu của kỹ thuật. Vấn đề ở đây là các mẫu đem đi xét nghiệm bằng kỹ thuật sinh học phân tử đã ở giai đoạn muộn do trước đó mẫu đã được xét nghiệm dương tính với IgM và IgG kháng Orientia tsutsugamushi [63], [64]. Hơn nữa, tác giả đã giải trình tự gene, phân tích tính cây di truyền phả hệ các mẫu PCR dương tính, kết quả cho thấy các chủng Orientia tsutsugamushi phát hiện ở điểm nghiên cứu có tính đa dạng di truyền so với các chủng lưu hành trong khu vực [116].
Bộ kit Orientia tsutsugamushi Genesig
Bộ kit là sản phẩm thương mại của Hãng Primerdesign Ltd. (Anh Quốc) được thiết kế phát hiện Orientia tsutsugamushi bằng kỹ thuật qPCR, có khả năng định lượng in vitro bộ gen O.tsutsugamushi. Bộ kit được thiết kế để có thể phát hiện rộng rãi và đặc hiệu với hầu hết hệ gen của các lồi
O.tsutsugamushi. Mồi và probe trong bộ kit này có độ tương đồng 100% với
một loạt các trình tự gen O. tsutsugamushi.
Nguyên lý hoạt động của bộ kit Orientia tsutsugamushi Genesig: Hỗn hợp mồi và probe đặc hiệu với Orientia tsutsugamushi được cung cấp và
được phát hiện thông qua kênh FAM. Hỗn hợp mồi và probe được của bộ kit hoạt động theo ngun tắc TaqMan®. Trong q trình khuếch đại PCR, mồi ngược và ngược xi lai hóa với ADN Orientia tsutsugamushi. Probe có tín hiệu huỳnh quang trong hỗn hợp phản ứng bao gồm một đầu 5’-dye và 3’- quencher. Trong quá trình khuếch đại PCR, probe được tách ra và chất phát huỳnh quang và chất thu nhận tín hiệu huỳnh quang (quencher) của probe được tách ra. Sự gia tăng tín hiệu huỳnh quang có thể được phát hiện trên các thiết bị qPCR.
Bộ kít có độ nhạy, độ đặc hiệu và khả năng phát hiện cao. Trong điều kiện PCR tối ưu, bộ kit Orientia tsutsugamushi Genesig có hiệu suất bắt cặp rất cao > 95% và có thể phát hiện được ở ngưỡng ít hơn 100 bản sao gen đích/phản ứng.
Cơng nghệ khuếch đại acid nucleic:
Xét nghiệm phân tích acid nucleic hứa hẹn mang lại cơng cụ chẩn đốn nhanh, nhạy và đặc hiệu đối với các bệnh ký sinh trùng. Các thiết bị chẩn đoán thế hệ mới cho phép phát hiện các mầm bệnh ký sinh trùng ngay tại thực địa, cho phép các nhà lâm sàng nhanh chóng đưa ra chẩn đốn tin cậy để có biện pháp điều trị hiệu quả. Bản chất sinh hoá phức tạp của các mẫu bệnh phẩm lâm sàng, nồng độ thấp của acid nucleic trong hầu hết các mẫu bệnh phẩm và công nghệ cảm biến sinh học hiện tại đòi hỏi chúng ta phải dùng đến một số công nghệ khuếch đại acid nucleic để cải thiện độ nhạy, đáp ứng được các yêu cầu trong lâm sàng khi phân tích các mẫu nhỏ, áp dụng trong phân tích mẫu tại thực địa [97], [141].
Xét nghiệm acid nucleic (NAT): Các nghiên cứu về cấu trúc của ADN, cơ chế phân tử của hiện tượng di truyền cùng với phát minh quan trọng liên quan đến phương pháp nhân gen PCR đã mang đến những cơng cụ hiệu quả để chẩn đốn bệnh ký sinh trùng. Mặc dù với những tiến bộ này, tiêu chuẩn vàng để xác định nhiều mầm bệnh vẫn là ni cấy và xác định kiểu hình của các tác nhân gây bệnh. Quy trình này thơng thường có thể mất nhiều ngày, bởi vậy sẽ ảnh hưởng đến việc điều trị nhanh và hiệu quả. Sự chậm trễ trong điều trị có thể ảnh hưởng rất lớn đến biến chứng và tử vong của các bệnh ký sinh trùng. Vì vậy, việc xác định chính xác các mầm bệnh cần được tiến hành nhanh chóng, để tăng hiệu quả điều trị và khả năng sống sót trong những trường hợp nhiễm ký sinh trùng nặng. Thêm vào đó như đúng tên gọi, các phương pháp nuôi cấy hiện nay chỉ xác định được các tác nhân phát triển trong môi trường ni cấy. Đối với các mầm bệnh khó ni cấy hoặc khơng
thể ni cấy trong phịng thí nghiệm thì chúng ta khơng thể áp dụng phương pháp nuôi cấy. Tuy nhiên, những mầm bệnh này vẫn có thể được xác định bằng phương pháp phân tử [46], [122].
Các kỹ thuật xét nghiệm acid nucleic trực tiếp phân tích các trình tự ADN, cho phép thu thập thông tin từ người bệnh và mầm bệnh. Khả năng đáp ứng với thuốc điều trị, các dấu ấn liên quan đến độc lực và chủng ký sinh trùng có thể được xác định nhanh chóng nhờ kỹ thuật NAT. Ngồi ra, NAT là kỹ thuật rất hiệu quả để nhanh chóng phân biệt các mầm bệnh có biểu hiện lâm sàng giống nhau, nhưng phác đồ điều trị khác nhau [56], [93]. Trên cơ sở đó, thầy thuốc có thể đưa ra biện pháp điều trị tối ưu cho bệnh nhân. Bên cạnh chẩn đoán phát hiện mầm bệnh, các lĩnh vực mới được phát triển như định lượng mầm bệnh để tiên lượng điều trị, y học cá thể và chẩn đoán phụ trợ địi hỏi cần có cơng nghệ phân tích gen nhanh chóng và có thể tiến hành ở thực địa ngay gần người bệnh [105], [144].
Hầu hết các cơng nghệ phân tích acid nucleic hiện nay có giá thành rất cao và cần người làm xét nghiệm được đào tạo, do vậy chỉ phù hợp với các phịng thí nghiệm ở trung tâm được đầu tư nhiều với nguồn lực dồi dào ở các thành phố và đô thị lớn. Điều này khiến những lợi ích của xét nghiệm phân tích acid nucleic khơng đến được với những cư dân sinh sống ở những vùng có nguồn lực hạn chế và ở các khu vực địa lý biệt lập. Bởi vậy, cơng nghệ chẩn đốn phân tử với giá thành hợp lý, không quá phức tạp là hết sức cần thiết để bảo vệ sức khoẻ của từng cá nhân và cộng đồng. Những tiến bộ khoa học kỹ thuật gần đây cho thấy các trang thiết bị phân tích acid nucleic có thể được thu nhỏ, dễ dàng vận chuyển xuống thực địa .
Xét nghiệm dựa trên phân tích acid nucleic có nhiều phương pháp khác nhau, được thực hiện trong phịng thí nghiệm hay xét nghiệm ở thực địa, đều nhằm mục đích xác định, định lượng các trình tự acid nucleic đặc hiệu trong các mẫu bệnh phẩm lâm sàng đặc trưng cho sự có mặt, diễn biến, tiên lượng,
dự đốn đáp ứng điều trị của các loại mầm bệnh. Bước khuếch đại acid nucleic có thể tách biệt với bước đọc tín hiệu trong NAT. Trước hết là trong bước khuếch đại (điển hình là PCR), các acid nucleic được tách chiết từ các mẫu lâm sàng, tiếp theo là bước đọc tín hiệu từ các sản phẩm khuếch đại. Quy trình hai bước này cho phép độ nhạy và độ đặc hiệu tách biệt nhau về khơng gian và thời gian. Độ nhạy có thể đạt được nhờ khuếch đại hiệu quả mà không ảnh hưởng nhiều đến độ đặc hiệu. Độ đặc hiệu sau đó sẽ được tối ưu nhờ thiết kế bước phát hiện nhằm giảm thiểu ảnh hưởng của các tín hiệu khơng đặc hiệu. Các phương pháp như vậy đã được mô tả chi tiết, sử dụng nhiều và áp dụng rộng rãi trong chẩn đoán nhiều loại mầm bệnh khác nhau. Vì vậy, các xét nghiệm với bước khuếch đại và phát hiện tách biệt nhau có thể làm cơ sở để phát triển các xét nghiệm acid nucleic tiếp theo. Tuy nhiên, điểm hạn chế của phương pháp NAT này là do sự khuếch đại đồng thời các trình tự khơng đặc hiệu dẫn tới cạnh tranh các thành phần có trong phản ứng khuếch đại. Phương pháp xét nghiệm NAT có bước khuếch đại và phát hiện tách biệt có quy trình bao gồm nhiều bước, dẫn tới thao tác phức tạp và tăng thời gian cho ra kết quả. Điều này đặt ra yêu cầu cần phải phát triển phương pháp xét nghiệm NAT tích hợp bước khuếch đại với bước phát hiện để đơn giản hố quy trình và rút ngắn được thời gian cho ra kết quả xét nghiệm.
Phương pháp xét nghiệm NAT tích hợp bước khuếch đại và phát hiện dựa trên các phát minh liên quan đến probe ADN gắn huỳnh quang và các chất nhuộm phát huỳnh quang khi gắn vào sợi kép, cho phép định lượng theo thời gian thực sản phẩm khuếch đại ở cả PCR và các phản ứng khuếch đại đẳng nhiệt. Các phản ứng khuếch đại đẳng nhiệt với độ đặc hiệu cao cho phép tiến hành các xét nghiệm phát hiện sản phẩm khuếch đại theo cách thức không đặc hiệu là đủ để khẳng định sự có mặt của các trình tự cần quan tâm. Phản ứng LAMP cịn tạo ra sản phẩm phụ khơng hồ tan, có thể định lượng nhờ đo độ đục. Hạn chế của những cơng nghệ này là cần phải duy trì độ nhạy
kỹ thuật trong khi phải tối ưu điều kiện phản ứng để đạt được độ đặc hiệu phù hợp tránh tạo ra các sản phẩm khơng đặc hiệu và dương tính giả. Việc sử dụng các probe huỳnh quang như TaqMan và Molecular beacon có ưu điểm khi kết hợp khuếch đại và phát hiện đối với những phản ứng mà nếu sử dụng phương pháp phát hiện không đặc hiệu sẽ dẫn tới độ đặc hiệu không đảm bảo. Đo tín hiệu theo thời gian thực sử dụng probe đồng thời cho phép kết hợp các probe có màu khác nhau, mở ra khả năng sử dụng tính đa mồi để phát hiện cùng lúc nhiều trình tự đích trong cùng một phản ứng. Việc kết hợp khuếch đại với phát hiện trong một ống xét nghiệm là điều được mong đợi vì sẽ giúp đơn giản hố quy trình thí nghiệm và rút ngắn thời gian cho ra kết quả [100], [144].
Bên cạnh các công nghệ khuếch đại acid nucleic, một số công nghệ mới phát hiện trực tiếp acid nucleic không qua khuếch đại cũng đang được phát triển. Những kỹ thuật này áp dụng các kỹ thuật phát hiện có độ nhạy cao để xác định các trình tự đích trong mẫu bệnh phẩm mà khơng cần khuếch đại. Điều này mở ra khả năng thực hiện các quy trình đơn giản, giảm sử dụng các hố chất và đơn giản hoá các hệ thống thực hiện xét nghiệm. Sự thành công của những hệ thống như vậy chỉ phụ thuộc vào việc phát triển các hệ thống cảm ứng ổn định với độ nhạy cao cho phép phát hiện nồng độ rất thấp của acid nucleic trong các mẫu bệnh phẩm lâm sàng phức tạp trong khi vẫn duy trì được độ đặc hiệu phù hợp với mục đích chẩn đốn. Các hệ thống phát hiện trực tiếp acid nucleic đã được thương mại hoá, như hệ thống sử dụng barcode phân tử của hãng NanoString (Mỹ) hoặc các hệ thống sử dụng nano silicon, nano carbon và quantum dot. Tuy nhiên, những hệ thống này chưa phù hợp cho mục đích xét nghiệm tại thực địa và vẫn còn cần được phát triển và đánh giá thêm để phục vụ cho mục đích chẩn đốn [60], [61], [62].
Trong khi các cảm biến sinh học để phát hiện trực tiếp acid nucleic không qua khuếch đại đang được phát triển, hiện nay các hệ thống NAT tích
hợp với khuếch đại acid nucleic có khả năng phát hiện một cách tin cậy từ các mẫu bệnh phẩm lâm sàng phức tạp với độ nhạy và độ đặc hiệu thoả mãn các yêu cầu lâm sàng. Để thực hiện NAT, chúng ta cần phải tiến hành khuếch đại tín hiệu hoặc khuếch đại trình tự đích. Phương pháp PCR đã cách mạng hóa lĩnh vực di truyền và chẩn đoán phân tử bằng cách mang đến một giải pháp hiệu quả và đơn giản để khuếch đại acid nucleic sử dụng các enzyme polymerase chịu nhiệt và chu trình luân nhiệt để tách sợi và gắn mồi. Công nghệ ưu việt này đã được mô tả chi tiết và được ứng dụng rộng rãi trong chẩn đoán phân tử, trong các nghiên cứu y sinh và khoa học sự sống. Hai thập kỷ gần đây chứng kiến sự ra đời của nhiều thiết bị PCR ngày càng hiện đại. Tuy nhiên, chu trình nhiệt trong phản ứng PCR đòi hỏi hệ thống trang thiết bị phức tạp, do đó PCR khơng phải là giải pháp hồn hảo cho các xét nghiệm tại thực địa. [65], [78], [88].
Để khắc phục những giới hạn của phương pháp PCR truyền thống trong kỷ nguyên khuếch đại acid nucleic dùng trong chẩn đoán phân tử tại thực địa, các nghiên cứu gần đây có xu hướng chuyển sang các phương pháp khuếch đại acid nucleic đẳng nhiệt. Các phương pháp khuếch đại đẳng nhiệt sử dụng các enzyme để thực hiện bước tách sợi, khác với phương pháp PCR truyền thống buộc phải sử dụng nhiệt độ cao. Những kỹ thuật khuếch đại đẳng nhiệt là công cụ rất hữu ích để phát triển các mơ hình chẩn đốn tại thực địa có khả năng khuếch đại acid nucleic mà không cần các bước luân nhiệt và các cơ chế điều khiển liên quan [109], [111] .
Một trong những phương pháp khuếch đại đẳng nhiệt đáng chú ý dựa vào các cấu trúc ADN dạng vòng (LAMP) đã được phát triển thành một phương pháp rất triển vọng có khả năng thay thế cho PCR. Ngồi gen đích groEL, tác giả Hubber và cộng sự đã mô tả việc sử dụng vùng gen bảo tồn 47 kDa làm gen đích của xét nghiệm LAMP và đạt được độ nhạy tương đương với PCR realtime [103], [145].
Công nghệ khuếch đại đẳng nhiệt Recombinase Polymerase Amplification
Ngày nay, một số công nghệ khuếch đại acid nucleic đẳng nhiệt khác cũng đã được quan tâm phát triển với nhiều ưu điểm nổi bật. Trong số đó, Recombinase polymerase amplification (RPA) là công nghệ sử dụng hỗn hợp các recombinase của sinh vật tiền nhân để giúp các primer gắn đặc hiệu vào gen đích. Enzyme ADN polymerase thay thế sợi (tiểu phần lớn của Bacillus subtilis PolI, Bsu) xúc tác phản ứng kéo dài primer để tổng hợp sợi ADN mới bổ sung [50]. Đầu tiên, enzyme recombinase được sử dụng để liên kết với mồi tạo thành phức hợp nucleoprotein recombinase. Phức hợp này sẽ trượt và tìm kiếm trình tự tương đồng trên phân tử ADN mạch kép để hình thành cấu trúc D-loop. Trong khi đó, một phân tử protein bám sợi đơn ADN sẽ bám và ổn định mạch bổ sung. Cuối cùng, enzyme ADN polymerase bắt đầu tổng hợp sản phẩm theo hướng từ vị trí mồi bắt cặp đến đích.
Hình 1.5. Các bước của chu trình khuếch đại đẳng nhiệt RPA
Đặc điểm quan trọng trong RPA là việc sử dụng enzyme recombinase và phân tử SSB để thay thế cho bước biến tính trong PCR truyền thống. Kỹ thuật RPA đã phát huy tối đa những ưu thế về tính đơn giản, tiết kiệm chi phí và thời gian phản ứng rất ngắn. Để xác định trình tự mục tiêu, RPA yêu cầu 2 mồi oligonucleotide được thiết kế đơn giản (có thể cần thêm 1 probe) để phản ứng bắt cặp xảy ra. Phương pháp có độ đặc hiệu trình tự cao trong hỗn hợp acid nucleic mà khơng cần tách chiết mẫu. Công nghệ này cho phép