STT Thành phần Nồng độ Đơn vị
1 Primer 0,54 µM
2 Probe 0,10 µM
3 MgOAc 18,00 mM
Một trong những yếu tố giúp cải thiện ngưỡng phát hiện của phản ứng RPA chính là điều kiện và thành phần phản ứng. Thực tế cho thấy ngưỡng phát hiện của công nghệ RPA là 10 copy/phản ứng, với điều kiện nhiệt độ tối ưu là 37ºC, nồng độ mồi, probe và MgOAc lần lượt là 0,54 µM, 0,1 µM và 18 mM. Các điều kiện này được tối ưu đảm bảo hiệu suất phản ứng RPA là cao nhất và phù hợp với điều kiện thương mại hóa, phục vụ chế tạo kit phát hiện Orientia tsutsugamushi.
3.2.2.3. Chế tạo panel gồm nhiều dải nồng độ plasmid chứa trình tự gen
đích của Orientia tsutsugamushi
Nghiên cứu chế tạo panel độ nhạy gồm nhiều nồng độ plasmid chứa trình tự gen đích của Orientia tsutsugamushi thực hiện theo sơ đồ sau:
Hình 3.3. Sơ đồ các bước xây dựng panel mẫu chuẩn
- Tính tốn số bản copy của mẫu chuẩn: Sau khi tách dịng gen (mục 3.2.1.1), đã tiến hành tính tốn số bản sao gen đích như sau:
+ Nồng độ stock: 20,1 ng/µl (Orientia tsutsugamushi).
+ Khối lượng phân tử của plasmid chứa đoạn gen đích của Orientia tsutsugamushi là 1.987.423,3 đvC (gồm khối lượng của vector Pjet 1,2 blunt
và kích thước đoạn ADN đích chèn vào vector tách dòng). Số bản sao trong 1 phản ứng của Orientia tsutsugamushi tính tốn được là: 8,3 x 1011 (bản sao/µl).
- Pha lỗng ADN tạo bộ mẫu chuẩn
Số lượng bản sao gen đích ban đầu đã tính tốn (8,3 x 1011 bản sao/µl) được pha lỗng xuống nồng độ 1011 bản sao/µl, sau đó pha lỗng theo hệ số 10, tạo nên dải nồng độ từ 1011 bản sao/µl - 100 bản sao/µl.
Tách chiết ADN
Tính tốn số bản copy
Pha loãng ADN tạo bộ mẫu chuẩn
Thực hiện phản ứng Realtime PCR trên bộ mẫu chuẩn
Thực hiện phản ứng RPA trên bộ mẫu chuẩn Tách dòng gen
- Đánh giá panel qua xây dựng đường chuẩn
Panel dải nồng độ từ 100 đến 108 bản sao/µl được sử dụng để đánh giá đường chuẩn trong kỹ thuật realtime PCR và RPA.
+ Kết quả đánh giá panel trên kỹ thuật realtime PCR:
Hình 3.4. Xây dựng panel sử dụng kỹ thuật realtime PCR
Dải nồng độ phát hiện của bộ mẫu chuẩn O. tsutsugamushi trong 8/9
mẫu chuẩn (108 - 100 copy/µl) đều cho tín hiệu khuếch đại, chứng âm khơng có khn ADN, khơng cho tín hiệu khuếch đại.
Kết quả cho thấy các giá trị chu kỳ ngưỡng (Ct) khác nhau trong các ống phản ứng realtime PCR sớm hay muộn tương quan tuyến tính với số lượng bản sao gen đích có trong phản ứng. Từ kết quả này, thiết bị realtime PCR đã xuất ra đường biểu diễn tương quan tuyến tính giữa giá trị Ct với log của nồng độ ADN của Orientia tsutsugamushi có trong các mẫu khác nhau của bộ mẫu chuẩn, cho phép đánh giá chính xác chất lượng panel đã tạo ra.
Hình 3.5. Đường chuẩn của bộ mẫu chuẩn
Kết quả cho thấy hệ số tương quan tuyến tính là R2 = 0,99253, có nghĩa là đường biểu diễn đạt tuyến tính cao. Do đó, đường chuẩn của bộ mẫu chuẩn có tương quan tuyến tính rất tốt và có khả năng định lượng ADN Orientia
tsutsugamushi với độ tin cậy cao.
+ Kết quả đánh giá panel trên kỹ thuật RPA:
Hình 3.6. Dải nồng độ phát hiện Orientia tsutsugamushi sử dụng công nghệ khuếch đại đẳng nhiệt RPA
Kết quả cho thấy sự tương quan về mặt thời gian phát hiện sản phẩm khi sử dụng kỹ thuật RPA khuếch đại các nồng độ ADN khác nhau. Khi số lượng bản sao gen đích càng thấp thì thời gian phát hiện sản phẩm khuếch đại càng muộn và ngược lại.
3.2.2.4. Đánh giá ngưỡng phát hiện của từng công nghệ sử dụng panel độ nhạy với các nồng độ khác nhau
Từ kết quả đánh giá ngưỡng phát hiện bằng các công nghệ khác nhau cho thấy: Kỹ thuật realtime PCR có khả năng phát hiện 7/8 nồng độ trong bộ mẫu chuẩn với nồng độ thấp nhất có thể phát hiện là 10 copy/phản ứng, hệ số tương quan tuyến tính là R2=0,99253 và hiệu suất của phản ứng là 92%. Như vậy, kỹ thuật realtime PCR có khả năng phát hiện tới 10 copy/phản ứng. Đánh giá ngưỡng phát hiện kỹ thuật RPA trên panel độ nhạy với dãy các nồng độ khác nhau cũng cho kết quả tương đương, kỹ thuật có khả năng phát hiện được mẫu ADN của Orientia tsutsugamushi ở nồng độ 101 copy/phản ứng ở điều kiện đẳng nhiệt (37℃) trong thời gian ngắn (<20 phút), nhanh hơn rất nhiều so với các công nghệ khác như PCR hay Realtime PCR.
3.2.2.5. Đánh giá độ đặc hiệu của từng công nghệ
Đánh giá độ đặc hiệu của từng công nghệ bằng cách sử dụng panel đặc hiệu bao gồm các mẫu bệnh phẩm âm tính với Orientia tsutsugamushi và các mẫu bệnh phẩm dương tính với một số lồi vi sinh vật thường gặp trong chẩn đoán phân biệt.
- Kết quả đánh giá độ đặc hiệu trên các mẫu bệnh phẩm âm tính với Orientia tsutsugamushi:
Dựa vào kết quả realtime PCR và RPA kiểm tra độ đặc hiệu khuếch đại ADN Orientia tsutsugamushi và các mẫu bệnh phẩm âm tính. Kết quả cho thấy kỹ thuật realtime PCR và RPA đã thiết lập đều có độ đặc hiệu 100% khi đánh giá trên 15 mẫu bệnh phẩm âm tính với O.tsutsugamushi.
Độ đặc hiệu = Â í ậ
Hình 3.7. Kết quả realtime PCR kiểm tra độ đặc hiệu khuếch đại ADN
Orientia tsutsugamushi với các mẫu bệnh phẩm âm tính
Hình 3.8. Kết quả RPA kiểm tra độ đặc hiệu khuếch đại ADN Orientia
tsutsugamushi với các mẫu bệnh phẩm âm tính
- Đánh giá độ đặc hiệu từng công nghệ trên các mẫu bệnh phẩm dương
tính với một số lồi vi sinh vật thường gặp trong chẩn đoán phân biệt:
Trong nghiên cứu này đã sử dụng 13 chủng vi sinh vật gồm Leptospira
interrogan serovar Pomona, Leptospira interrogan serovar Australis, Leptospira biflexa serovar Patoc, Dengue virus, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, Enterobacter aerogenes, Klebsiella pneumoniae, E.coli, Sal spp., Neisseria gonorhoeae, M.catahalis, Haemophilus influenzae
để đánh giá độ đặc hiệu kỹ thuật quy trình đã tối ưu hóa của từng cơng nghệ realtime PCR và RPA.
Kết quả đánh giá độ đặc hiệu kỹ thuật của công nghệ realtime PCR và RPA trên các chủng vi sinh vật thường gặp trong chẩn đoán phân biệt với bệnh sốt mị cho thấy 2 cơng nghệ có độ đặc hiệu cao: Chứng dương cho tín hiệu khuếch đại sớm, chứng âm khơng có tín hiệu khuếch đại chứng tỏ q trình phản ứng khơng có nhiễm chéo hay hiện tượng mồi bắt cặp, các ống bổ sung ADN các chủng vi sinh vật khác khơng cho tín hiệu khuếch đại. Độ đặc hiệu kỹ thuật của công nghệ realtime PCR khuếch đại ADN Orientia tsutsugamushi đều là 13/(13 + 0) x 100% = 100%.
3.2.3. Xây dựng quy trình chế tạo kit chẩn đốn Orientia tsutsugamushi
3.2.3.1. Lựa chọn cơng nghệ khuếch đại acid nucleic có khả năng chẩn
đốn Orientia tsutsugamushi với độ nhạy và độ đặc hiệu cao nhất để hồn thiện quy trình và xây dựng quy trình chế tạo kit
- Lựa chọn cơng nghệ:
+ So sánh ngưỡng phát hiện (độ nhạy) của hai công nghệ realtime PCR và RPA sử dụng các dãy nồng độ khác nhau. Kết quả chu kỳ ngưỡng tương ứng với các nồng độ được trình bày ở bảng sau: