Chương 2 : ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu chế tạo bộ sinh phẩm (kit)
2.2.4. Các kỹ thuật đã áp dụng chế tạo bộ kit
2.2.4.1. Kỹ thuật thu thập, bảo quản và tách chiết mẫu
- Quy trình kỹ thuật lấy mẫu máu tĩnh mạch ngoại vi người để xét nghiệm: Mẫu máu tĩnh mạch ngoại vi với thể tích 5 ml/lần được lấy vào ống
chứa chất chống đơng K2 EDTA. Trong vịng 6 tiếng sau khi lấy, mẫu máu được vận chuyển đến labo, tách huyết tương bằng ly tâm 1.500 vòng/phút trong thời gian 5 phút và chuyển sang tube nhựa polypropylene. Phần tế bào máu sẽ được bảo quản trong ngân hàng cho mục đích phân tích gen bổ sung khi cần thiết. Mẫu huyết tương và tế bào được bảo quản ở tủ âm -20°C đến khi phân tích.
- Tách chiết ADN từ mẫu máu, huyết tương hoặc huyết cầu: ADN được tách chiết bằng bộ kit Anapure ADN/ARN Viral Mini Kit Anabio (Việt
Nam), sử dụng quy trình tách huyết tương và dịch cơ thể theo khuyến cáo của nhà sản xuất. Thể tích máu, huyết tương hoặc huyết cầu được sử dụng để tách chiết ADN là 600µl và thể tích ADN tách chiết thu được cuối cùng là 60µl. Kiểm tra nồng độ và chất lượng của mẫu ADN tách chiết được bằng cách sử dụng bộ kit đo nồng độ ADN siêu nhạy (5 pg/µL) trên hệ thống Fragment Analyzer của hãng Advance Analytical (Mỹ).
2.2.4.2. Kỹ thuật PCR và điện di phân tích sản phẩm PCR
- Kỹ thuật PCR truyền thống: PCR là phản ứng chuỗi khuếch đại vật chất di truyền ADN trong ống nghiệm (in-vitro) sử dụng hai mồi (primer) xuôi và ngược. Phản ứng chuỗi này cho phép nhân số lượng đoạn gen quan tâm rất nhanh, theo hàm mũ luỹ thừa của 2 sau mỗi chu kỳ (từ một chuỗi thành khoảng một tỉ chuỗi sau 30 chu kỳ). Sản phẩm của phản ứng PCR truyền thống được phát hiện và phân tích sau khi kết thúc tồn bộ phản ứng. Kỹ thuật PCR là một công cụ mạnh trong sinh học phân tử, sản phẩm của nó có thể dùng cho nhiều mục đích khác nhau như xác nhận sự có mặt của tác nhân gây bệnh, giải trình tự gen trực tiếp, tạo dịng phân tử...
- Kỹ thuật điện di phân tích ADN: để có thể phát hiện/phân tích được ADN chiết tách từ các mẫu có nguồn gốc khác nhau hoặc từ sản phẩm PCR. Người ta thường dùng phương pháp điện di ngang với gel agarose để phân tích ADN tách chiết hoặc sản phẩm PCR với nồng độ gel khác nhau và cho kết quả rất tốt. Sau khi điện di, các bản gel được nhuộm với ethidium bromide, đọc kết quả và chụp ảnh dưới đèn UV. Nghiên cứu này áp dụng phương pháp điện di mao quản giúp phân tích ADN trong các mẫu nghiên cứu với độ phân giải và độ nhạy cao hơn.
- Giải trình tự gen: kích thước các sản phẩm PCR sau khi điện di được xác định dựa vào thang ADN chuẩn. Băng ADN được cho là sản phẩm của phản ứng với mồi đặc hiệu sẽ được cắt khỏi gel agarose và tinh sạch bằng kit. Các sản phẩm tinh sạch được dùng trực tiếp cho giải trình tự gen hoặc
tạo dịng phân tử sau đó sẽ giải trình tự gen. Kết quả giải trình tự gen được so sánh với trình tự gen của ngân hàng, và so sánh các mẫu với nhau dựa vào phần mềm chuyên dụng.
2.2.4.3. Kỹ thuật tách dịng gen
Sản phẩm PCR chứa trình tự gen đích 47kDa của O.tsutsugamushi được cắt bởi enzyme giới hạn BamHI để thu được đoạn ADN đầu dính (sticky- end), chèn vào vector tách dịng pJET1.2/blunt. Ngay sau đó đoạn chèn và vector tách dòng pJET1.2 được lai với nhau bằng enzyme T4 ligase và được biến nạp vào tế bào khả biến (tế bào E.coli DH5α).
Plasmid tái tổ hợp được tách chiết từ 3ml dịch nuôi cấy sử dụng bộ Plasmid Miniprep Kit (Qiagen) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Sau khi tách chiết, plasmid tái tổ hợp được kiểm tra, đánh giá chất lượng bằng phương pháp đo mật độ quang xác định nồng độ plasmid và phương pháp giải trình tự. Plasmid tinh sạch thu được được sử dụng làm gen đích để tối ưu các phản ứng realtime PCR và RPA.
2.2.4.4. Kỹ thuật realtime PCR định lượng
- Nguyên lý phương pháp realtime PCR định lượng: Realtime PCR định lượng dựa trên việc đo tín hiệu quang liên tục sau mỗi chu kỳ trong quá trình diễn biến của phản ứng PCR huỳnh quang, qua đó xác định được nồng độ của lượng ADN khuôn ban đầu. Trong phản ứng PCR này, bên cạnh 2 mồi xuôi và ngược để khuếch đại đoạn gen quan tâm như trong phương pháp PCR thơng thường cịn có thêm một mẫu dị đặc hiệu có khả năng phát ra tín hiệu huỳnh quang khi xảy ra phản ứng PCR. Mẫu dò đặc hiệu này được khoá đầu 3’ để ngăn khơng cho nó kéo dài chuỗi trong phản ứng PCR. Mặc dù, một đầu của mẫu dò này được gắn với một phân tử phát ra tín hiệu huỳnh quang với bước sóng xác định (FAM), nhưng trong điều kiện bình thường tín hiệu huỳnh quang này bị hấp thụ hoàn toàn bởi một phân tử khác ở đầu còn lại của mẫu dò. Trong bước kéo dài chuỗi của phản ứng PCR, hoạt tính
5’-3’ exonuclease của enzyme Taq phân cắt làm tách xa 2 đầu của mẫu dị đặc hiệu này, nhờ đó mà đầu FAM của mẫu dị này có thể phát ra tín hiệu huỳnh quang và có thể đo được liên tục sau mỗi chu kỳ phản ứng.
- Thực hiện phản ứng realtime PCR: Tổng thể tích phản ứng realtime PCR sử dụng là 20µl với 5µl ADN O.tsutsugamushi. Để cải thiện hiệu suất phản ứng, MgSO4 nồng độ 3 mM được bổ sung vào phản ứng; nồng độ mồi và probe tối ưu lần lượt là 1,5µM và 0,05µM. Phản ứng được thực hiện trên máy Rotor-Gene với chu trình nhiệt gồm các bước: Biến tính ban đầu 95℃ trong 15 phút, sau đó là 45 chu kỳ (biến tính ở 94℃ trong 15s, gắn mồi ở 63℃ trong 30s và kéo dài mạch ở 72℃ trong 30s), tín hiệu huỳnh quang được thu nhận ở bước kéo dài mạch.
2.2.4.5. Kỹ thuật Recombinase polymerase amplification
- Nguyên lý phản ứng RPA: Trong phản ứng RPA, các recombinase
Trong phản ứng RPA, 2 protein quan trọng được sử dụng để thay thế bước biến tính trong PCR là RecA recombinase từ Escherichia coli (hoặc T4 UvsX protein) và protein bám mạch ADN đơn (single stranded DNA-binding protein, SSB). Đầu tiên, RecA recombinase sẽ gắn lên sợi ADN mạch đơn (mồi và probe) hình thành phức hợp nucleoprotein. Sau đó, các sợi nucleoprotein này sẽ tiến hành trượt trên ADN mạch đơi để qt và tìm kiếm các trình tự tương đồng. Nếu phát hiện có vị trí tương đồng giữa sợi nucleoprotein và một mạch ADN, sẽ bắt cặp bổ sung với trình tự đích trên ADN mạch đơi hình thành cấu trúc vòng D (D-loop), dẫn đến phân tách các chuỗi ADN cục bộ trong đó chuỗi bổ sung được ổn định bởi SSB protein và trình tự gen đích đã được gắn với mồi. Sau đó RecA recombinase được tách ra khỏi sợi nucleoprotein nhờ quá trình thủy phân ATP của protein RecA và sự sao chép để kéo dài mồi được thực hiện bởi một ADN polymerase có hoạt tính thay thế sợi. Các chuỗi ADN mới được tạo ra sẽ được sử dụng cho một vòng RPA khác. Do đó, sự khuếch đại theo cấp số nhân được thực hiện qua
các chu trình RPA lặp lại, phản ứng tiếp tục diễn ra đến khi cạn kiệt nhóm phosphocreatine, không cung cấp năng lượng cho các enzyme hoạt động.
- Thực hiện phản ứng RPA: Tổng thể tích phản ứng được sử dụng là
20µl gồm các thành phần có nồng độ như đề xuất của nhà sản xuất (TwistAmp Exo), trong đó nồng độ primer, probe tối ưu lần lượt là 0,54µM và 0,1µM với thể tích ADN O.tsutsugamushi là 2µL. Phản ứng được thực hiện ở 37℃ trong 20 phút.
2.2.4.6. Phương pháp đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu
- Độ nhạy là tỷ lệ những trường hợp thực sự có bệnh và có kết quả xét nghiệm dương tính trong tổng số các trường hợp có bệnh. Độ nhạy được xác định bằng công thức sau:
Độ nhạy = số ca dương tính thật
số ca dương tính thật + số ca âm tính giả
- Độ đặc hiệu là tỷ lệ những trường hợp thực sự khơng có bệnh và có kết quả xét nghiệm âm tính trong tổng số các trường hợp khơng bị bệnh. Độ đặc hiệu được xác định bằng công thức sau:
Độ đặc hiệu = số ca âm tính thật
số ca âm tính thật + số ca dương tính giả
2.2.4.7. Phương pháp đánh giá độ chính xác
Độ chính xác là độ trùng hợp giữa giá trị trung bình của thử nghiệm với giá trị được cơng nhận là chuẩn. Độ chính xác của quy trình được xác định với cách tiếp cận như sau: So sánh kết quả thu được từ các quy trình chẩn đốn Orientia tsutsugamushi thử nghiệm với các kết quả đã biết trên
10 bệnh phẩm giả định. Mẫu bệnh phẩm giả định là các mẫu huyết tương của người khỏe mạnh và được bổ sung một lượng đã biết Orientia tsutsugamushi. Kết quả của quy trình phát hiện Orientia tsutsugamushi được so sánh với hàm lượng O. tsutsugamusi trên 10 mẫu bệnh phẩm giả định. Đối với mỗi bệnh phẩm, tiến hành tách chiết ADN và thực hiện 3 phản ứng RPA độc lập, sử dụng cùng lơ hóa chất và cùng máy đẳng nhiệt.
2.2.4.8. Phương pháp đánh giá độ lặp lại của quy trình
Độ lặp lại của quy trình là mức độ giống nhau giữa các lần lặp lại khi tiến hành quy trình trong cùng điều kiện và giữa các điều kiện khác nhau.
Độ lặp lại của quy trình trong nghiên cứu này được khảo sát trên 10 bệnh phẩm đã được kiểm tra dương tính. Các bệnh phẩm này được chia làm 2 phần dùng để phân tích bởi 2 kỹ thuật viên khác nhau.
Đối với mỗi mẫu, hai kỹ thuật viên tại Viện Nghiên cứu Y - Dược học quân sự, Học viện Quân y tiến hành tách chiết ADN và thực hiện phản ứng RPA khuếch đại acid nucleic theo quy trình của bộ kit thử nghiệm. Trong mỗi lần xét nghiệm, mỗi mẫu được thực hiện lặp lại 3 lần.
2.2.4.9. Phương pháp so sánh độ tương hợp với bộ kit nước ngoài
Sử dụng Primerdesign genesig kit phát hiện Orientia tsutsugamushi
để tiến hành so sánh so sánh độ tương hợp với bộ kit phát hiện Orientia tsutsugamushi được chế tạo.
Trong nghiên cứu y học, để so sánh giữa 2 phương pháp xét nghiệm, cần tìm sự tương hợp giữa 2 phương pháp. Sự tương hợp của 2 phương pháp được xác định thơng qua chỉ số Kappa. Cơng thức tính chỉ số Kappa:
K = p p 1 p
Với: p0 = xác suất tương hợp quan sát (observed). pe = xác suất tương hợp kỳ vọng (expected).
Theo Altman (1991), phân độ mạnh của tương hợp như sau: K < 0,20: Kém
K = 0,21 - 0,40: Khá
K = 0,41 - 0,60: Trung bình
K = 0,61 - 0,80: Tốt
K = 0,81 - 1,00: Rất tốt
Phương pháp Phương pháp A Cộng (+) (-) Phương pháp B (+) a b a + b (-) c d c + d Cộng a + c b + d n = a + b + c + d p0 = ; pe = ( × ) + ( × )
2.2.4.10. Phương pháp đánh giá độ ổn định của bộ kit
Tính ổn định của bộ kit được kiểm tra liên tục tại các thời điểm sau 7, 14, 30, 60 và 90 ngày trong điều kiện được bảo quản ở - 20°C. So sánh kết quả với bộ kit mới pha được thử nghiệm cùng trên 1 mẫu âm tính và 1 mẫu dương tính với Orientia tsutsugamushi.
Tính ổn định của bộ kit phát hiện O. tsutsugamushi được đánh giá dựa trên kết quả xét nghiệm dương hoặc âm tính với Orientia tsutsugamushi và việc so sánh thời gian thu nhận được tín hiệu khuếch đại khi sử dụng bộ kit đang bảo quản với bộ kit mới trên cùng một mẫu bệnh phẩm. Bệnh phẩm sử dụng là bệnh phẩm được thu thập ngay trước khi tiến hành thí nghiệm và bộ kit mới được chuẩn bị ngay trước khi tiến hành thí nghiệm.