Chương 2 : ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu một số đặc điểm nhiễm
2.1.6. Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu
2.1.6.1. Kỹ thuật lấy, bảo quản mẫu huyết thanh
- Lấy 5 ml máu tĩnh mạch ngoại vi người, cho vào ống đựng có chất chống đơng EDTA.
- Ly tâm ở nhiệt độ thường với tốc độ 1.500 vòng/phút trong thời gian 5 phút.
- Tách chuyển phần huyết tương sang ống đựng mới.
- Bảo quản ở -20°C trong thời gian ngắn (dưới 1 tháng), và lưu ở tủ âm sâu -80°C trong thời gian dài.
2.1.6.2. Kỹ thuật xét nghiệm phát hiện kháng thể kháng O.
tsutsugamushi ở người
Sử dụng bộ sinh phẩm phát hiện kháng thế kháng O.tsutsugamushi ELISA Panbio kit (Úc) có độ nhậy 96,6% và độ đặc hiệu 94,4%. Thực hiện xét nghiệm theo quy trình hướng dẫn của Nhà sản xuất.
2.1.6.3. Kỹ thuật bẫy thu thập chuột và định loại
- Sử dụng bẫy lồng kích thước 24 x 14 x 14cm (mắt lưới bẫy 15x15 mm). Tại mỗi điểm nghiên cứu đặt 10 đêm, mỗi đêm đặt 100 bẫy, gồm: 50 bẫy trong nhà/50 nhà và 50 bẫy ngoài nhà. Bẫy đặt trong nhà và đặt ngoài nương rẫy, rừng cách nhà ở 100-500m. Mồi bẫy chuột bằng khoai lang, sắn hoặc bắp ngô tươi.
- Định loại chuột theo Bộ gặm nhấm - Động vật chí Việt Nam [23].
2.1.6.4. Kỹ thuật xét nghiệm tìm kháng thể kháng Orientia
tsutsugamushi trên chuột
Sử dụng test SD BIOLINE Tsutsugamushi (Hàn Quốc) có độ nhạy 84,0% và độ đặc hiệu 94,4%. Thực hiện xét nghiệm theo quy trình hướng dẫn của Nhà sản xuất.
- Lấy que thử khỏi túi nhôm, đặt lên một nơi bằng phẳng và khô ráo. - Dùng bơm tiêm lấy máu tim chuột, nhỏ 1 giọt vào giếng mẫu (S). Nhỏ
tiếp 3 - 4 giọt (khoảng 100~120 μl) dung mơi pha lỗng.
- Khi phản ứng bắt đầu sẽ nhìn thấy vạch màu tím di chuyển đến giữa cửa sổ kết quả trên thanh que thử.
- Đọc kết quả sau 10 ~ 15 phút.
2.1.6.5. Kỹ thuật thu thập ấu trùng mò
Thu thập ấu trùng mò trên chuột sau khi đã gây mê lấy huyết thanh. Kiểm tra tìm ấu trùng mị ký sinh trên chuột ngay để tránh một số mò đã đốt no tự rơi xuống. Kiểm tra toàn bộ thân nhưng chú ý tìm bắt mị ký sinh ở những bộ phận cơ thể như ở tai, quanh hậu môn, quanh lỗ sinh dục, trong hốc mũi; Nếu phát hiện có ấu trùng mị, dùng kim mũi mác gỡ mò ký sinh trên chuột cho vào tube chứa cồn 700. Ấu trùng mò thu được ở từng con chuột đựng riêng từng týp có nhãn (viết bằng bút chì trên giấy bóng mờ) ghi: số thứ tự (theo số điều tra), địa điểm, thời gian thu thập, tên lồi chuột và nút chặt bằng bơng khơng thấm nước rồi cho vào lọ nhựa có nắp bảo quản và
đem về phịng thí nghiệm phân tích [15].
2.1.6.6. Định loại mị
Định loại mò chủ yếu dựa vào các đặc điểm hình thái bên ngồi của cơ thể ấu trùng mị, vì giai đoạn này mị sống ký sinh trên các loài động vật nên dễ dàng thu thập hơn những giai đoạn khác. Ấu trùng mò thu được từ điểm nghiên cứu sẽ sẽ được gắn trên lam kính để định loại dưới kính hiển vi. Định loại theo tài liệu phân loại mò ở Việt Nam [7], [10].
Cơ thể ấu trùng gồm hai phần: Đầu giả và thân.
Đầu giả (Gnathosoma):
Đầu giả gồm: Gốc đầu (gnathobase), kìm (chelicera), pan (palp), họng (hypostoma) và bao kìm (galea).
- Gốc đầu cố định, phía dưới gốc đầu có 1 đơi lơng phân nhánh gọi là lơng gốc đầu và lỗ điểm. Lỗ điểm rời rạc hay xếp thành hàng. Cách sắp xếp lỗ điểm là đặc điểm để phân loại tới giống.
- Kìm gồm hai phần: Gốc kìm (chelobase) cố định và phiến kìm (blade) cử động. Phiến kìm gồm thân và ngọn hay cịn gọi đỉnh kìm, trên đó thường có răng. Số lượng, hình dạng và cách sắp xếp răng trên kìm khác nhau tùy thuộc vào giống và loài.
- Pan (palp) gồm 5 đốt: Đốt chuyển (palptrochanter), đùi (palpfemur), gối (palpgenu), cẳng (palptibia) và bàn (palptarsus). Trên các đốt đều có lơng được gọi là lơng pan (palpsetae). Hình dạng và số lượng lông pan là đặc điểm phân loại tới lồi.
Thân mị (Idiasoma):
Thân của ấu trùng là phần hình cầu sau đầu giả, kích thước và hình dạng phụ thuộc vào độ no, đói của ấu trùng và tùy từng loài. Chiều dài thân từ 200 - 2.000 µm, khơng được q 2.000 µm. Hình dạng thân thay đổi từ dài đến trịn, có hay khơng có chỗ thắt giữa. Mặc dù có sự thay đổi về kích thước, nhưng trong phạm vi một lồi hình dạng khơng thay đổi, lúc no cũng như lúc
đói. Mặt lưng của thân có mai hay khiên lưng (scutum) và lông lưng. Mặt bụng có gốc đầu giả, các đốt hay các đốt hang (coxae) của các chân, lông ức (sternal seta), lông bụng (ventral sea) và lỗ sinh dục (anus).
Đặc điểm hình thái ấu trùng mị:
Hình 2.2. Hình thái bên ngồi ấu trùng mò Leptotrombidium (L.) deliense
Walch, 1922 (Theo Nadchatram và Dohany, 1974) (Nguyễn Văn Châu, Trần Thanh Dương [10]) 1. Pan (palp)
2. Kìm (chelicera)
3. Lơng bao kìm (galea seta) 4. Mắt (ocellus) 5. Lơng bên gần mút bàn (parasupterminala) 6. Lông gần mút bàn (subterminala) 7. Cựa bàn I (tarsala) 8. Gai bàn I (microtarsala) 9. Gai cẳng I (microtibiala) 10. Gậy cẳng I (tibiala) 11. Gậy đốt gối I (genuala)
18. Đốt bàn (tarsum)
19. Lông trước vuốt (pretarsala) 20. Mai lưng (scutum)
21. Lông vai (humeral) 22. Hàng lông lưng thứ nhất 23. Hàng lơng lưng thứ hai 24. Móng (claw)
25. Đệm (epodium)
26. Lông đuôi (caudal seta) 27. Lỗ hậu môn (anus) 28. Lông bụng (ventral seta) 29. Gốc chân (coxa) III
12. Gai đốt gối I (microtibiala) 13. Đốt chuyển (trochanter) 14. Đốt gốc đùi (basifemur) 15. Đốt gốc đùi (telofemur) 16. Đốt gối (genu) 17. Đốt cẳng (tibia)
30. Lông gốc chân (coxal seta) 31. Lông ức (sternal seta) 32. Gốc chân (coxa) III 33. Lỗ thở (urtigma) 34. Gốc chân (coxa) I
2.1.6.7. Phương pháp phỏng vấn
Dùng bộ câu hỏi thiết kế sẵn để phỏng vấn. Trong q trình phỏng vấn chỉ có 2 người (điều tra viên và người được phỏng vấn), khơng có người thứ 3 để đảm bảo tính khách quan, trừ khi cần có người phiên dịch.