Chương 3 : KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.2. Kết quả nghiên cứu chế tạo bộ sinh phẩm phát hiện Orientia
3.2.2. Tối ưu hóa phản ứng khuếch đại acid nucleic bằng các công nghệ
khác nhau sử dụng ADN khuôn tổng hợp từ plasmid
3.2.2.1. Tối ưu điều kiện phản ứng bao gồm: nhiệt độ gắn mồi, thời gian các bước và tốc độ thay đổi nhiệt độ của phản ứng
Sau khi thực hiện các thử nghiệm, đã thiết lập được các điều kiện tối ưu của phản ứng Realtime PCR và phản ứng RPA khuếch đại ADN Orientia
tsutsugamushi, từ những kết quả thu được.
Bảng 3.17. Bảng điều kiện tối ưu của phản ứng Realtime PCR
TT Các bước Nhiệt độ Thời gian Đơn vị
1 Biến tính ban đầu 95 15 Phút
Khuếch đại Biến tính 94 15 Giây
2 (Số chu kỳ: 45) Gắn mồi 63 30 Giây
Kéo dài 72 30 Giây
3 Lưu mẫu 25 ∞
Bảng 3.18. Bảng điều kiện tối ưu của phản ứng RPA
TT Điều kiện phản ứng RPA Giá trị tối ưu Đơn vị
1 Nhiệt độ phản ứng 37 ºC
2 Thời gian thu nhận tín hiệu huỳnh quang 30 Giây
3.2.2.2. Tối ưu các thành phần phản ứng khuếch đại acid nucleic
- Tối ưu thành phần phản ứng realtime PCR
Nghiên cứu đã tiến hành khảo sát các nồng độ mồi khác nhau từ 0,1 - 1,5 µM, nồng độ probe từ 0,05 - 0,2 µM trong phản ứng realtime PCR phát hiện ADN O.tsutsugamushi. Để tăng hiệu suất phản ứng, MgSO4 được bổ
sung thêm vào phản ứng với các nồng độ 1, 2, 3 và 4 mM. Kết quả tối ưu được trình bày trên bảng sau:
Bảng 3.19. Bảng kết quả tối ưu thành phần phản ứng realtime PCR
STT Thành phần Nồng độ Đơn vị
1 Primer 1,5 µM
2 Probe 0,05 µM
3 MgSO4 3 mM
- Tối ưu thành phần phản ứng RPA
+ Tối ưu nồng độ primer:
Sử dụng dải nồng độ primer theo khuyến cáo của nhà sản xuất để tiến hành chọn nồng độ primer tối ưu nhất cho phản ứng. Dải nồng độ được sử dụng là 0,24; 0,36; 0,42; 0,54 µM. Kết quả thử nghiệm cho thấy, nồng độ primer tối ưu cho phản ứng RPA khuếch đại ADN Orientia tsutsugamushi
là 0,54 µM.
+ Tối ưu nồng độ probe
Thực hiện phản ứng RPA với các nồng độ probe từ 0,06; 0,08; 0,10; 0,12; và 0,15 µM để chọn nồng độ tối ưu. Kết quả nồng độ probe 0,1µM là nồng độ thấp cho tín hiệu khuếch đại sớm nhất (14,71 tương đương với 7,36 phút) nên được chọn là nồng độ tối ưu cho phản ứng RPA.
+ Tối ưu nồng độ MgOAc
Sử dụng dải nồng độ MgOAc lần lượt là 12 mM; 14 mM; 16 mM; 18 mM và 20 mM. Các phản ứng RPA được chạy đồng thời về các điều kiện nhiệt độ và thành phần, chỉ khác về nồng độ MgOAc. Nồng độ MgOAc tối ưu trong phản ứng RPA là 18 mM (nồng độ để phản ứng khuếch đại ADN cho tín hiệu sớm hơn).
Như vậy, nghiên cứu đã tối ưu thành công thành phần phản ứng RPA khuếch đại acid nucleic Orientia tsutsugamushi, cụ thể như sau:
Bảng 3.20. Tổng hợp kết quả tối ưu thành phần phản ứng RPA
STT Thành phần Nồng độ Đơn vị
1 Primer 0,54 µM
2 Probe 0,10 µM
3 MgOAc 18,00 mM
Một trong những yếu tố giúp cải thiện ngưỡng phát hiện của phản ứng RPA chính là điều kiện và thành phần phản ứng. Thực tế cho thấy ngưỡng phát hiện của công nghệ RPA là 10 copy/phản ứng, với điều kiện nhiệt độ tối ưu là 37ºC, nồng độ mồi, probe và MgOAc lần lượt là 0,54 µM, 0,1 µM và 18 mM. Các điều kiện này được tối ưu đảm bảo hiệu suất phản ứng RPA là cao nhất và phù hợp với điều kiện thương mại hóa, phục vụ chế tạo kit phát hiện Orientia tsutsugamushi.
3.2.2.3. Chế tạo panel gồm nhiều dải nồng độ plasmid chứa trình tự gen
đích của Orientia tsutsugamushi
Nghiên cứu chế tạo panel độ nhạy gồm nhiều nồng độ plasmid chứa trình tự gen đích của Orientia tsutsugamushi thực hiện theo sơ đồ sau:
Hình 3.3. Sơ đồ các bước xây dựng panel mẫu chuẩn
- Tính tốn số bản copy của mẫu chuẩn: Sau khi tách dòng gen (mục 3.2.1.1), đã tiến hành tính tốn số bản sao gen đích như sau:
+ Nồng độ stock: 20,1 ng/µl (Orientia tsutsugamushi).
+ Khối lượng phân tử của plasmid chứa đoạn gen đích của Orientia tsutsugamushi là 1.987.423,3 đvC (gồm khối lượng của vector Pjet 1,2 blunt
và kích thước đoạn ADN đích chèn vào vector tách dịng). Số bản sao trong 1 phản ứng của Orientia tsutsugamushi tính tốn được là: 8,3 x 1011 (bản sao/µl).
- Pha loãng ADN tạo bộ mẫu chuẩn
Số lượng bản sao gen đích ban đầu đã tính tốn (8,3 x 1011 bản sao/µl) được pha lỗng xuống nồng độ 1011 bản sao/µl, sau đó pha loãng theo hệ số 10, tạo nên dải nồng độ từ 1011 bản sao/µl - 100 bản sao/µl.
Tách chiết ADN
Tính tốn số bản copy
Pha lỗng ADN tạo bộ mẫu chuẩn
Thực hiện phản ứng Realtime PCR trên bộ mẫu chuẩn
Thực hiện phản ứng RPA trên bộ mẫu chuẩn Tách dòng gen
- Đánh giá panel qua xây dựng đường chuẩn
Panel dải nồng độ từ 100 đến 108 bản sao/µl được sử dụng để đánh giá đường chuẩn trong kỹ thuật realtime PCR và RPA.
+ Kết quả đánh giá panel trên kỹ thuật realtime PCR:
Hình 3.4. Xây dựng panel sử dụng kỹ thuật realtime PCR
Dải nồng độ phát hiện của bộ mẫu chuẩn O. tsutsugamushi trong 8/9
mẫu chuẩn (108 - 100 copy/µl) đều cho tín hiệu khuếch đại, chứng âm khơng có khn ADN, khơng cho tín hiệu khuếch đại.
Kết quả cho thấy các giá trị chu kỳ ngưỡng (Ct) khác nhau trong các ống phản ứng realtime PCR sớm hay muộn tương quan tuyến tính với số lượng bản sao gen đích có trong phản ứng. Từ kết quả này, thiết bị realtime PCR đã xuất ra đường biểu diễn tương quan tuyến tính giữa giá trị Ct với log của nồng độ ADN của Orientia tsutsugamushi có trong các mẫu khác nhau của bộ mẫu chuẩn, cho phép đánh giá chính xác chất lượng panel đã tạo ra.
Hình 3.5. Đường chuẩn của bộ mẫu chuẩn
Kết quả cho thấy hệ số tương quan tuyến tính là R2 = 0,99253, có nghĩa là đường biểu diễn đạt tuyến tính cao. Do đó, đường chuẩn của bộ mẫu chuẩn có tương quan tuyến tính rất tốt và có khả năng định lượng ADN Orientia
tsutsugamushi với độ tin cậy cao.
+ Kết quả đánh giá panel trên kỹ thuật RPA:
Hình 3.6. Dải nồng độ phát hiện Orientia tsutsugamushi sử dụng công nghệ khuếch đại đẳng nhiệt RPA
Kết quả cho thấy sự tương quan về mặt thời gian phát hiện sản phẩm khi sử dụng kỹ thuật RPA khuếch đại các nồng độ ADN khác nhau. Khi số lượng bản sao gen đích càng thấp thì thời gian phát hiện sản phẩm khuếch đại càng muộn và ngược lại.
3.2.2.4. Đánh giá ngưỡng phát hiện của từng công nghệ sử dụng panel độ nhạy với các nồng độ khác nhau
Từ kết quả đánh giá ngưỡng phát hiện bằng các công nghệ khác nhau cho thấy: Kỹ thuật realtime PCR có khả năng phát hiện 7/8 nồng độ trong bộ mẫu chuẩn với nồng độ thấp nhất có thể phát hiện là 10 copy/phản ứng, hệ số tương quan tuyến tính là R2=0,99253 và hiệu suất của phản ứng là 92%. Như vậy, kỹ thuật realtime PCR có khả năng phát hiện tới 10 copy/phản ứng. Đánh giá ngưỡng phát hiện kỹ thuật RPA trên panel độ nhạy với dãy các nồng độ khác nhau cũng cho kết quả tương đương, kỹ thuật có khả năng phát hiện được mẫu ADN của Orientia tsutsugamushi ở nồng độ 101 copy/phản ứng ở điều kiện đẳng nhiệt (37℃) trong thời gian ngắn (<20 phút), nhanh hơn rất nhiều so với các công nghệ khác như PCR hay Realtime PCR.
3.2.2.5. Đánh giá độ đặc hiệu của từng công nghệ
Đánh giá độ đặc hiệu của từng công nghệ bằng cách sử dụng panel đặc hiệu bao gồm các mẫu bệnh phẩm âm tính với Orientia tsutsugamushi và các mẫu bệnh phẩm dương tính với một số lồi vi sinh vật thường gặp trong chẩn đoán phân biệt.
- Kết quả đánh giá độ đặc hiệu trên các mẫu bệnh phẩm âm tính với Orientia tsutsugamushi:
Dựa vào kết quả realtime PCR và RPA kiểm tra độ đặc hiệu khuếch đại ADN Orientia tsutsugamushi và các mẫu bệnh phẩm âm tính. Kết quả cho thấy kỹ thuật realtime PCR và RPA đã thiết lập đều có độ đặc hiệu 100% khi đánh giá trên 15 mẫu bệnh phẩm âm tính với O.tsutsugamushi.
Độ đặc hiệu = Â í ậ
Hình 3.7. Kết quả realtime PCR kiểm tra độ đặc hiệu khuếch đại ADN
Orientia tsutsugamushi với các mẫu bệnh phẩm âm tính
Hình 3.8. Kết quả RPA kiểm tra độ đặc hiệu khuếch đại ADN Orientia
tsutsugamushi với các mẫu bệnh phẩm âm tính
- Đánh giá độ đặc hiệu từng cơng nghệ trên các mẫu bệnh phẩm dương
tính với một số lồi vi sinh vật thường gặp trong chẩn đoán phân biệt:
Trong nghiên cứu này đã sử dụng 13 chủng vi sinh vật gồm Leptospira
interrogan serovar Pomona, Leptospira interrogan serovar Australis, Leptospira biflexa serovar Patoc, Dengue virus, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, Enterobacter aerogenes, Klebsiella pneumoniae, E.coli, Sal spp., Neisseria gonorhoeae, M.catahalis, Haemophilus influenzae
để đánh giá độ đặc hiệu kỹ thuật quy trình đã tối ưu hóa của từng cơng nghệ realtime PCR và RPA.
Kết quả đánh giá độ đặc hiệu kỹ thuật của công nghệ realtime PCR và RPA trên các chủng vi sinh vật thường gặp trong chẩn đoán phân biệt với bệnh sốt mị cho thấy 2 cơng nghệ có độ đặc hiệu cao: Chứng dương cho tín hiệu khuếch đại sớm, chứng âm khơng có tín hiệu khuếch đại chứng tỏ q trình phản ứng khơng có nhiễm chéo hay hiện tượng mồi bắt cặp, các ống bổ sung ADN các chủng vi sinh vật khác khơng cho tín hiệu khuếch đại. Độ đặc hiệu kỹ thuật của công nghệ realtime PCR khuếch đại ADN Orientia tsutsugamushi đều là 13/(13 + 0) x 100% = 100%.
3.2.3. Xây dựng quy trình chế tạo kit chẩn đốn Orientia tsutsugamushi
3.2.3.1. Lựa chọn cơng nghệ khuếch đại acid nucleic có khả năng chẩn
đoán Orientia tsutsugamushi với độ nhạy và độ đặc hiệu cao nhất để hồn thiện quy trình và xây dựng quy trình chế tạo kit
- Lựa chọn công nghệ:
+ So sánh ngưỡng phát hiện (độ nhạy) của hai công nghệ realtime PCR và RPA sử dụng các dãy nồng độ khác nhau. Kết quả chu kỳ ngưỡng tương ứng với các nồng độ được trình bày ở bảng sau:
Bảng 3.21. So sánh các thông số về chu kỳ ngưỡng tương ứng với các nồng độ của từng công nghệ với các nồng độ của từng cơng nghệ
Nồng độ (copy/5µL)
Thời gian khuếch đại
Realtime PCR (chu kỳ) RPA (phút)
106 21,21 2,83 105 24,34 3,75 104 24,18 4,98 103 27,23 6,77 102 27,41 7,78 101 32,15 11,29
Nhận xét:
Kết quả đánh giá cho thấy cả 2 công nghệ realtime PCR và RPA khuếch đại ADN Orientia tsutsugamushi đều có ngưỡng phát hiện là 10 copy/phản ứng. Bên cạnh đó, kết quả cho thấy cơng nghệ RPA khuếch đại ADN Orientia tsutsugamushi đẳng nhiệt có thời gian khuếch đại ADN
Orientia tsutsugamushi nhanh hơn đáng kể so với công nghệ Realtime PCR.
Như vậy, các ngưỡng phát hiện với từng đối tượng là đáng tin cậy và phù hợp để ứng dụng rộng rãi trong chẩn đoán Orientia tsutsugamushi và chế tạo kit chẩn đốn Orientia tsutsugamushi. Trong đó, cơng nghệ RPA
khuếch đại ADN Orientia tsutsugamushi có độ nhạy cao và thời gian khuếch đại nhanh nhất.
+ So sánh độ đặc hiệu của hai công nghệ realtime PCR và RPA sử dụng panel độ đặc hiệu:
Kết quả so sánh độ đặc hiệu của từng công nghệ bằng cách sử dụng panel độ đặc hiệu bao gồm các mẫu bệnh phẩm âm tính với Orientia tsutsugamushi và các mẫu bệnh phẩm dương tính với một số lồi vi sinh vật
thường gặp trong chẩn đốn phân biệt được trình bày ở bảng sau:
Bảng 3.22. So sánh độ đặc hiệu của từng công nghệ Mẫu đánh giá Độ đặc hiệu kỹ thuật (%) Mẫu đánh giá Độ đặc hiệu kỹ thuật (%)
Realtime PCR RPA
Đánh giá trên mẫu bệnh phẩm âm
tính với Orientia tsutsugamushi 100 100 Đánh giá trên các mẫu vi khuẩn có
thể gây triệu chứng tương tự. 100 100
Nhận xét:
Kết quả đánh giá độ đặc hiệu của từng công nghệ (realtime PCR và RPA) khuếch đại ADN Orientia tsutsugamushi trên 15 mẫu bệnh phẩm âm tính Orientia tsutsugamushi với và 13 mẫu bệnh phẩm dương tính với các
mẫu vi khuẩn có thể gây triệu chứng tương tự như Orientia tsutsugamushi cho thấy cả hai công nghệ đều cho độ đặc hiệu cao (100%) đảm bảo độ chính xác kỹ thuật và khả năng ứng dụng trong chẩn đoán sớm mầm bệnh.
Như vậy, cả 2 công nghệ Realtime PCR và RPA khuếch đại acid nucleic Orientia tsutsugamushi đều có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, đảm bảo để ứng dụng trong chế tạo bộ kit phát hiện Orientia tsutsugamushi cũng như trong chẩn đốn bệnh sốt mị. Tuy nhiên, với yêu cầu thực tế tại các địa bàn trọng điểm địi hỏi cơng nghệ khuếch đại acid nucliec chẩn đoán Orientia tsutsugamushi phải là phương pháp chẩn đốn nhanh, chính xác, thiết bị gọn
nhẹ, dễ mang đi. RPA là phương pháp có nhiều ưu điểm nổi bật, cho phép khuếch đại gen đích với hiệu suất rất cao ở nhiệt độ phản ứng 37°C và thời gian phát hiện sau 20 phút. Vì vậy, cơng nghệ RPA khuếch đại acid nucleic
Orientia tsutsugamushi đã được chọn để hồn thiện quy trình chế tạo kit.
3.2.3.2. Sản xuất thử nghiệm 500 test chẩn đoán Orientia tsutsugamushi
Từ kết quả đánh giá độ nhạy và độ đặc hiệu của các công nghệ khuếch đại ADN Orientia tsutsugamushi cho thấy công nghệ RPA khuếch đại đẳng nhiệt độ nhạy, độ đặc hiệu cũng như ưu điểm trong ứng dụng lâm sàng. Do đó, đề tài đã lựa chọn công nghệ RPA khuếch đại acid nucleic Orientia tsutsugamushi để sản xuất thử nghiệm bộ kit chẩn đoán Orientia tsutsugamushi.
Bảng 3.23. Thành phần của bộ kit
TT Thành phần Ký hiệu Thể tích
1 Reaction Buffer A1, A2 600 µl
2 dNTPs B1, B2 100 µl 3 Probe E-mix C1, C2 120 µl 4 Nuclease-freewwater D1, D2 200 µl 5 Orientia tsutsugamushi oligo-mix I1, I2 100 µl 6 Exo E1, E2 22 µl
7 Core Reaction Mix F1, F2 60 µl
8 Positive Control G1, G2 100 µl
9 MgOAc H1, H2 100 µl
Bộ sinh phẩm Orientia tsutsugamushi RPA minikit được đóng gói
gồm 50 test/hộp. Tổng số 500 test đã được chế tạo.
Hình 3.9. Hình ảnh bộ sinh phẩm chẩn đoán Orientia tsutsugamushi
3.2.3.3. Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu, độ chính xác và độ lặp lại trong mỗi lần xét nghiệm và giữa các lần xét nghiệm của bộ kit
- Độ nhạy, độ đặc hiệu:
tích 37 mẫu bệnh phẩm dương tính (nhóm bệnh) và 100 mẫu bệnh phẩm âm tính (nhóm chứng).
Kết quả phát hiện thấy Orientia tsutsugamushi trong 36 mẫu bệnh phẩm dương tính, tương đương với độ nhạy của bộ kit phát hiện Orientia tsutsugamushi là 97,3% (36/37).
Trên nhóm chứng khỏe mạnh, kết quả khơng phát hiện thấy Orientia
tsutsugamushi trong 99 mẫu bệnh phẩm âm tính, tương ứng với độ đặc hiệu
của bộ kit phát hiện Orientia tsutsugamushi là 99% (99/100). - Độ chính xác:
Thử nghiệm phát hiện Orientia tsutsugamushi với kit phát hiện
Orientia tsutsugamushi lặp lại 3 lần trên 10 mẫu bệnh phẩm giả định. Trong
số 10 bệnh phẩm giả định thử nghiệm có 2 mẫu bệnh phẩm âm tính với
Orientia tsutsugamushi và 8 mẫu bệnh phẩm có chứa các hàm lượng Orientia tsutsugamushi khác nhau. Kết quả cho thấy bộ kit phát hiện Orientia tsutsugamushi phù hợp 100% với kết quả đã biết của 10 mẫu bệnh phẩm giả
định. Như vậy, bộ kit phát hiện Orientia tsutsugamushi có độ chính xác cao. - Độ lặp lại:
Hai kỹ thuật viên Viện nghiên cứu Y - Dược học quân sự, Học viện Quân y sử dụng kit phát hiện Orientia tsutsugamushi để phát hiện Orientia
tsutsugamushi trên 10 mẫu bệnh phẩm giả định. Trong đó, có 2 mẫu bệnh phẩm âm tính với Orientia tsutsugamushi và 8 mẫu bệnh phẩm có chứa các hàm lượng Orientia tsutsugamushi khác nhau từ 150 bản sao/phản ứng đến 145.000 bản sao/phản ứng. Kết quả cho thấy các mẫu có nồng độ ≥ 500 bản sao/phản ứng, độ lặp lại của bộ kit rất tốt thể hiện qua kết quả giống nhau trong 3 lần lặp lại được thực hiện bởi 1 người và so sánh giữa 2 người thực hiện. Các mẫu có nồng độ <500 bản sao/phản ứng có độ lặp lại thấp hơn. Như vậy, bộ kit phát hiện Orientia tsutsugamushi có độ lặp lại tốt.
3.2.3.4. Đánh giá độ ổn định của quy trình khuếch đại acid nucleic chẩn