3.2.3.3. Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu, độ chính xác và độ lặp lại trong mỗi lần xét nghiệm và giữa các lần xét nghiệm của bộ kit
- Độ nhạy, độ đặc hiệu:
tích 37 mẫu bệnh phẩm dương tính (nhóm bệnh) và 100 mẫu bệnh phẩm âm tính (nhóm chứng).
Kết quả phát hiện thấy Orientia tsutsugamushi trong 36 mẫu bệnh phẩm dương tính, tương đương với độ nhạy của bộ kit phát hiện Orientia tsutsugamushi là 97,3% (36/37).
Trên nhóm chứng khỏe mạnh, kết quả không phát hiện thấy Orientia
tsutsugamushi trong 99 mẫu bệnh phẩm âm tính, tương ứng với độ đặc hiệu
của bộ kit phát hiện Orientia tsutsugamushi là 99% (99/100). - Độ chính xác:
Thử nghiệm phát hiện Orientia tsutsugamushi với kit phát hiện
Orientia tsutsugamushi lặp lại 3 lần trên 10 mẫu bệnh phẩm giả định. Trong
số 10 bệnh phẩm giả định thử nghiệm có 2 mẫu bệnh phẩm âm tính với
Orientia tsutsugamushi và 8 mẫu bệnh phẩm có chứa các hàm lượng Orientia tsutsugamushi khác nhau. Kết quả cho thấy bộ kit phát hiện Orientia tsutsugamushi phù hợp 100% với kết quả đã biết của 10 mẫu bệnh phẩm giả
định. Như vậy, bộ kit phát hiện Orientia tsutsugamushi có độ chính xác cao. - Độ lặp lại:
Hai kỹ thuật viên Viện nghiên cứu Y - Dược học quân sự, Học viện Quân y sử dụng kit phát hiện Orientia tsutsugamushi để phát hiện Orientia
tsutsugamushi trên 10 mẫu bệnh phẩm giả định. Trong đó, có 2 mẫu bệnh phẩm âm tính với Orientia tsutsugamushi và 8 mẫu bệnh phẩm có chứa các hàm lượng Orientia tsutsugamushi khác nhau từ 150 bản sao/phản ứng đến 145.000 bản sao/phản ứng. Kết quả cho thấy các mẫu có nồng độ ≥ 500 bản sao/phản ứng, độ lặp lại của bộ kit rất tốt thể hiện qua kết quả giống nhau trong 3 lần lặp lại được thực hiện bởi 1 người và so sánh giữa 2 người thực hiện. Các mẫu có nồng độ <500 bản sao/phản ứng có độ lặp lại thấp hơn. Như vậy, bộ kit phát hiện Orientia tsutsugamushi có độ lặp lại tốt.
3.2.3.4. Đánh giá độ ổn định của quy trình khuếch đại acid nucleic chẩn đoán Orientia tsutsugamushi trong máu của bệnh nhân sốt mị
Tính ổn định của bộ kit phát hiện Orientia tsutsugamushi được đánh giá dựa trên kết quả dương/âm tính và việc so sánh thời gian thu nhận được tín hiệu khuếch đại giữa các phản ứng sử dụng lô sản phẩm bảo quản và lô sản phẩm mới trên cùng một mẫu bệnh phẩm. bệnh phẩm sử dụng là bệnh phẩm thu thập ngay trước khi tiến hành thí nghiệm; lô sản phẩm mới được chuẩn bị ngay trước khi tiến hành thí nghiệm.
Bảng 3.24. Kết quả đánh giá độ ổn định của bộ kit dựa trên kết quả phát hiện Orientia tsutsugamushi trong mẫu bệnh phẩm
Thời gian bảo quản Kết quả XN của lô sản phẩm bảo quản
Kết quả XN của lô sản phẩm mới
7 ngày bảo quản + +
14 ngày bảo quản + +
30 ngày bảo quản + +
60 ngày bảo quản + +
90 ngày bảo quản + +
Nhận xét:
Kết quả cho thấy với cùng một mẫu bệnh phẩm được phân tích trên lơ sản phẩm đã qua bảo quản theo thời gian 7, 14, 30, 60 và 90 ngày cùng với lô sản phẩm mới, kết quả phát hiện Orientia tsutsugamushi trên mẫu bệnh phẩm sử dụng lô sản phẩm đã qua bảo quản trùng hợp 100% so với lô sản phẩm chuẩn bị mới.
Bảng 3.25. Kết quả đánh giá độ ổn định bộ kit dựa trên thời gian thu nhận được tín hiệu khuếch đại
Thời gian bảo quản
Kết quả thử nghiệm lô sản phẩm bảo quản
Kết quả thử nghiệm lô sản phẩm mới
7 ngày bảo quản 6,72 phút 6,59 phút
14 ngày bảo quản 6,49 phút 6,17 phút
30 ngày bảo quản 7,44 phút 6,59 phút
60 ngày bảo quản 7,45 phút 6,72 phút
90 ngày bảo quản 7,78 phút 6,77 phút
Nhận xét:
Thời gian thu nhận được tín hiệu khuếch đại sử dụng lơ sản phẩm đã qua bảo quản muộn hơn khi sử dụng lô sản phẩm mới chuẩn bị với thời gian chênh lệch trung bình là 36,48 giây. Như vậy bộ kit phát hiện Orientia tsutsugamushi có tính ổn định cho đến ít nhất 90 ngày trong điều kiện bảo
quản phù hợp (-200C).
3.2.3.5. So sánh với bộ kit khuếch đại acid nucleic chẩn đoán Orientia
tsutsugamushi của nước ngoài
Sử dụng Primerdesign genesig kit phát hiện Orientia tsutsugamushi
để tiến hành so sánh các thông số kỹ thuật với bộ kit đẳng nhiệt RPA phát hiện Orientia tsutsugamushi được chế tạo. Các thông số kỹ thuật được sử
dụng để so sánh bao gồm: độ nhạy và độ đặc hiệu, độ chính xác, độ lặp lại, độ tương hợp giữa hai bộ kit.
- Độ nhạy và độ đặc hiệu:
Sử dụng 2 bộ kit phát hiện Orientia tsutsugamushi (bộ kit đẳng nhiệt RPA và bộ kit Genesig) để phân tích 37 mẫu máu của bệnh nhân được chẩn đoán xác định trên lâm sàng là bệnh sốt mị thể thơng thường điển hình (nhóm bệnh) và 100 mẫu máu của người khỏe mạnh (nhóm chứng).
Bảng 3.26. So sánh độ nhạy kit đẳng nhiệt RPA phát hiện Orientia tsutsugamushi với bộ kit Genesig Orientia tsutsugamushi với bộ kit Genesig
Tiêu chí Số lượng
Kit sử dụng Kit đẳng nhiệt
RPA Kit Genesig
Số ca dương tính thật (TP) 37 36 36
Số ca âm tính giả (FN) 0 1 1
Độ nhạy TP/TP+FN 97,3 % 97,3 %
Ghi chú: TP: True positive, FN: False Negaive
Bảng 3.27. So sánh độ đặc hiệu kit đẳng nhiệt RPA phát hiện
Orientia tsutsugamushi với bộ kit Genesig
Tiêu chí Số lượng
Kit sử dụng Kit đẳng nhiệt
RPA Kit Genesig
Số ca âm tính thật (TN) 100 99 100
Số ca dương tính giả (FP) 0 1 0
Độ đặc hiệu TN/TN+FP 99 % 100 %
Ghi chú: TN: True Negative, FP: False Positive Nhận xét:
Kết quả so sánh ở bảng 3.26 và bảng 3.27 cho tháy bộ kit đẳng nhiệt RPA phát hiện Orientia tsutsugamushi có độ nhạy và độ đặc hiệu tương
đương với bộ kit Primerdesign genesig. - Độ chính xác:
Thử nghiệm lặp lại 2 lần trên 10 mẫu bệnh phẩm giả định cho thấy kết quả phát hiện Orientia tsutsugamushi của cả 2 bộ kit đẳng nhiệt và bộ kit
Primerdesign genesig phù hợp 100% với kết quả đã biết của 10 mẫu bệnh phẩm giả định. Như vậy, độ chính xác của bộ kit đẳng nhiệt phát hiện
Orientia tsutsugamushi tương đương với độ chính xác của bộ kit Primerdesign genesig.
- Độ lặp lại:
Hai kỹ thuật viên Viện nghiên cứu Y - Dược học quân sự, Học viện Quân y sử dụng kit phát hiện Orientia tsutsugamushi trên 10 mẫu bệnh phẩm giả định, trong đó có 2 mẫu bệnh phẩm âm tính với Orientia tsutsugamushi và 8 mẫu có chứa các hàm lượng Orientia tsutsugamushi khác nhau từ 150 bản sao/phản ứng đến 145.000 bản sao/phản ứng. Kết quả cho thấy:
+ Với bộ kit đẳng nhiệt RPA, các mẫu có nồng độ ≥ 500 bản sao/phản ứng, độ lặp lại của bộ kit rất tốt. Các mẫu có nồng độ <500 bản sao/phản ứng có độ lặp lại thấp hơn.
+ Với bộ kit Primerdesign genesig, 8 mẫu bệnh phẩm có chứa các hàm lượng Orientia tsutsugamushi khác nhau từ 150 bản sao/phản ứng đến 145.000 bản sao/phản ứng đều có độ lặp lại tốt thể hiện qua 2 lần lặp lại được thực hiện bởi 1 người và so sánh giữa 2 người thực hiện.
Như vậy, độ lặp lại của bộ kit phát hiện Orientia tsutsugamushi
Primerdesign genesig có độ lặp lại tốt hơn so với bộ kit đẳng nhiệt RPA phát hiện Orientia tsutsugamushi.
- Độ tương hợp giữa 2 bộ kit:
Bảng 3.28. Kết quả đánh giá độ tương hợp của 2 loại kit
Loại sinh phẩm Kit Genesig Cộng
Số ca (+) Số ca (-) Kit đẳng nhiệt (RPA) Số ca (+) 36 1 37 Số ca (-) 0 99 99 Cộng 36 100
- Xác suất tương hợp quan sát là: P0 = = 0,9854
- Xác suất tương hợp kỳ vọng là:
Pe = ( × ) + ( × ) = 0,598
Chỉ số Kappa là: K = , ,
. = 0,963
Như vậy, sự tương hợp giữa 2 phương pháp rất tốt (K nằm trong khoảng 0,81 - 1).
3.2.3.6. Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho bộ kit khuếch đại acid nucleic chẩn đoán Orientia tsutsugamushi
Đã xây dựng được bộ tiêu chuẩn cơ sở cho bộ kit khuếch đại acid nucleic đẳng nhiệt RPA chẩn đoán Orientia tsutsugamushi gồm các nội dung sau đây:
- Mục đích cả bộ kit.
- Phần nội dung: Nguyên lý, đích phát hiện, thành phần bộ kit, vật liệu hóa chất và thiết bị cung cấp bởi người sử dụng, cách tiến hành. - Đóng gói, ghi nhãn: Mơ tả sản phẩm và đóng gói.
(Nội dung tiêu chuẩn cơ sở chi tiết được trình bày ở Phụ lục 2).
3.2.3.7. Xây dựng quy trình xét nghiệm chẩn đoán Orientia
tsutsugamushi bằng kit khuếch đại acid nucleic đẳng nhiệt RPA
Hướng dẫn quy trình xét nghiệm chẩn đoán Orientia tsutsugamushi
bằng kit khuếch đại acid nucleic bằng công nghệ khuếch đại đẳng nhiệt RPA.
- Thực hiện phản ứng RPA khuếch đại acid nucleic:
+ Rã đơng hồn tồn các thành phần phản ứng và mẫu ADN đã tách chiết (nếu đông) và giữ chúng ở trên đá.
+ Trộn đều và ly tâm nhanh các thành phần phản ứng để được các hỗn hợp đồng nhất, sau đó giữ chúng ở trên đá để có hiệu quả xét nghiệm cao nhất.
Bảng 3.29. Thành phần hỗn hợp phản ứng STT Thành phần Nồng độ gốc Thể tích cho 1 STT Thành phần Nồng độ gốc Thể tích cho 1 phản ứng (µl) 1 Reaction Buffer 2 X 10 2 dNTPs 25 mM 1,44 3 Nuclease-freewater 0,52 4 Probe E-mix 10 X 2 5 Oligo-mix 1,64
Core Reaction Mix 20 X 1
6 Exo 50 X 0,4
Tổng thể tích dung dịch đệm thực hiện phản ứng 17
8 MgOAc 280 mM 1
9 Mẫu ADN 2
Tổng thể tích dung dịch thực hiện phản ứng 20
+ Đối với các thành phần Core Reaction Mix và Exo: bổ sung lần lượt từng thành phần lên nắp tube sau đó đảo trộn lên xuống 10 lần và ly tâm nhanh.
+ Đảo trộn bằng pipet các thành phần của dung dịch đệm trước khi chia 17 µl ra từng ống phản ứng 0,2 ml.
+ Bổ sung MgOAc và mẫu ADN với thể tích tương ứng lên nắp tube phản ứng.
+ Ly tâm nhanh để MgOAc và mẫu ADN rơi xuống đáy ống phản ứng ngay khi bắt đầu ủ.
+ Lưu ý: MgOAc giúp kích hoạt phản ứng diễn ra. Phản ứng RPA sẽ xảy ra khi MgOAc được thêm vào ngay cả khi ở nhiệt độ phịng. Do đó, hạn chế cho MgOAc tiếp xúc với master mix khi chưa ủ.
Bảng 3.30. Chu trình nhiệt
Nhiệt độ Thời gian Ghi chú
37°C 20 phút Khuếch đại (20 giây thu tín hiệu 1 lần) 4°C Không xác định Lưu mẫu trên máy
+ Chuyển các ống phản ứng vào máy đẳng nhiệt và bắt đầu phản ứng theo điều kiện phản ứng đã cài đặt.
- Đọc kết quả:
+ Kết quả phát hiện Orientia tsutsugamushi sử dụng bộ kit đẳng nhiệt RPA được xác định dựa vào tín hiệu khuếch đại thu được từ hệ thống thu nhận tín hiệu huỳnh quang.
+ Kiểm tra các mẫu đối chứng dương và đối chứng âm để đảm bảo kết quả xét nghiệm không phải là kết quả âm tính giả hoặc dương tính giả. Mẫu đối chứng dương phải cho kết quả dương tính và có thời gian thu nhận được tín hiệu khuếch đại trùng khớp với thời gian thu nhận được tín hiệu khuếch đại của mẫu đã được chuẩn độ trước đó (mẫu chứng dương cung cấp kèm bộ kit có thời gian thu nhận được tín hiệu khuếch đại là 8 - 10 phút).
Mẫu chứng âm phải cho kết quả âm tính.
+ Nếu hệ thống mẫu đối chứng dương và đối chứng âm khơng đúng thì phải thực hiện lại xét nghiệm.
Chương 4: BÀN LUẬN BÀN LUẬN
4.1. Một số đặc điểm nhiễm Orientia tsutsugamushi, ấu trùng mò và
phân bố bệnh sốt mò tại khu vực Tây Bắc
4.1.1. Điều tra huyết thanh phát hiện kháng thể Orientia tsutsugamushi lưu hành trong cộng đồng dân cư lưu hành trong cộng đồng dân cư
Việt Nam nằm ở tam giác dịch tễ bệnh sốt mò, bệnh đã được phát hiện từ đầu thế kỷ XX. Sau năm 1990, bệnh sốt mị có xu hướng gia tăng số mắc và mở rộng diện phân bố trong những năm gần đây [34].
Kết quả nghiên cứu cho thấy, tỷ lệ người có kháng thể kháng Orientia
tsutsugamushi có ở cả 4 điểm nghiên cứu với tỷ lệ khác nhau, tỷ lệ nhiễm chung của 4 điểm là 12,7%. Điểm nghiên cứu có tỷ lệ người có kháng thể kháng Orientia tsutsugamushi cao nhất là Hịa Bình 16,72%, tiếp đến là Điện Biên 14,42%, Sơn La 9,05% và Lai Châu 8,67%. Tuy nhiên, tỷ lệ người có kháng thể kháng Orientia tsutsugamushi ở các điểm nghiên cứu đều thấp hơn kết quả của tác giả Đoàn Trọng Tuyên và cộng sự (2010) khi điều tra huyết thanh học phát hiện kháng thể kháng Orientia tsutsugamushi trong cộng đồng dân cư tại Khánh Hòa (21,04%) [35]. Tỷ lệ nhiễm Orientia tsutsugamushi ở Hịa Bình và Điện Biên cao hơn ở Gia Lai (10,58%); tất cả
4 tỉnh nghiên cứu đều cao hơn Kon Tum (5,21%) [34].
Tỷ lệ nhiễm Orientia tsutsugamushi của nghiên cứu này cũng thấp hơn kết quả nghiên cứu của Bùi Trọng Chiến và cs khi xét nghiệm bằng kỹ thuật real-time PCR đã phát hiện tỷ lệ dương tính ở Khánh Hịa 47,90% và Quảng Ngãi 22,97%, nhưng cao hơn ở Quảng Nam 8,74% [16]. Kết quả nghiên cứu cũng thấp hơn so với kết quả của Đoàn Trọng Tuyên khảo sát huyết thanh học tại bệnh viện Khánh Hòa trên 86 mẫu thấy tỷ lệ nhiễm Orientia tsutsugamushi là 48,8% [34]. Điều này có thể do sự khác nhau về mật độ tập
trung, khả năng sàng lọc bệnh tại cộng đồng dân cư và trong bệnh viện. Kết quả nghiên cứu phù hợp với kết quả điều tra huyết thanh học của tác giả Ana Bonell và cộng sự (2017) tại một số nước ở khu vực châu Á. Số liệu điều tra dịch tễ học cho thấy bệnh sốt mò phổ biến ở nhiều nước châu Á, với tỷ lệ huyết thanh dương tính kháng thể kháng Orientia tsutsugamushi từ 9,3% -27,9% (trung bình 22,2%) [44]. Một số nước có tỷ lệ nhiễm cao như kết quả điều tra dịch tễ học huyết thanh của bệnh sốt mò ở những bệnh nhân mắc bệnh sốt cao tại Nepal cho thấy trong số 434 mẫu bệnh phẩm được thu thập từ tháng 7 đến tháng 11 năm 2015 đã phát hiện 175 mẫu (40,3%) dương tính kháng thể IgM đối với Orientia tsutsugamushi [135].
Các nghiên cứu sự lưu hành của sốt mò ở Hàn Quốc cho thấy, bệnh sốt mị đã xác định có lưu hành ở hầu hết các vùng thuộc Hàn Quốc. Kết quả điều tra huyết thanh bệnh nhân có biểu hiện sốt cấp tính, dịch tễ học và vi sinh vật học trên phạm vi cả nước từ 1986-1993 cho thấy tỷ lệ dương tính với kháng thể kháng Orientia tsutsugamushi là 27,7% - 51% [115]. Tại Trung Quốc, bệnh sốt mò được ghi nhận gia tăng nhanh về tỷ lệ mắc và mở rộng phạm vi phân bố địa lý trong cả nước. khá phổ biến và tăng nhanh trong suốt thời gian nghiên cứu từ năm 2006 đến 2014, tổng cộng 54.558 trường hợp mắc bệnh sốt mò được báo cáo. Số ca bệnh sốt mò đạt đỉnh điểm vào năm 2014, gấp 12,8 lần so với năm 2006. Hầu hếtcác trường hợp ở 5 tỉnh Quảng Đông, Vân Nam, An Huy, Phúc Kiến và Sơn Đơng (77,97%). Bệnh có tỷ lệ cao nhất ở nhóm tuổi 40-69 và nơng dân có tỷ lệ mắc bệnh cao hơn so với nhóm khác (P <0,001) [143].
Trong mơi trường hoang dã, ấu trùng mị trombiculid sống ở đất ẩm ướt hoặc cát sỏi. Ở những khu vực có dạng sinh cảnh rừng nhiệt đới, cây bụi, dạng cây gai, cánh đồng và rừng cỏ rậm rạp chạy dọc sông và cánh đồng lúa liên quan tới sự tồn tại của Orientia tsutsugamushi. Vector truyền bệnh có thể tìm thấy ở nơi động vật gặm nhấm phát triển cùng với độ ẩm phù hợp.
Người nhiễm bệnh qua vết đốt của ấu trùng mò họ trombiculidmites, mùa phát bệnh sốt mò được xác định là thời gian ấu trùng mò phát triển.
Bệnh sốt mò thường gặp ở những vùng rừng núi, cây cối rậm rạp, có nhiều cỏ dại, đặc biệt là những khu vực như bờ suối, hang hốc, rừng mới phá hoặc mới trồng, vùng giáp ranh, nơi nhiều cây con bụi rậm, các bãi cỏ ven sông suối, trên nương rẫy, những nơi có bóng dâm và đất mùn ẩm ướt,... Đây là những khu vực thường có nhiều lồi thú nhỏ lồi gặm nhấm sinh sống, có