Đặc điểm quan trọng trong RPA là việc sử dụng enzyme recombinase và phân tử SSB để thay thế cho bước biến tính trong PCR truyền thống. Kỹ thuật RPA đã phát huy tối đa những ưu thế về tính đơn giản, tiết kiệm chi phí và thời gian phản ứng rất ngắn. Để xác định trình tự mục tiêu, RPA yêu cầu 2 mồi oligonucleotide được thiết kế đơn giản (có thể cần thêm 1 probe) để phản ứng bắt cặp xảy ra. Phương pháp có độ đặc hiệu trình tự cao trong hỗn hợp acid nucleic mà khơng cần tách chiết mẫu. Công nghệ này cho phép khuếch đại gen đích bằng cách tổng hợp liên tục ADN mà khơng cần biến tính sợi kép ADN ở nhiệt độ cao. Xét nghiệm có thể được tiến hành trong khoảng nhiệt độ từ 24°C đến 45°C với hiệu suất rất cao nhờ đó có thể phát hiện được tín hiệu từ đơn phân tử đích chỉ sau 5 - 20 phút, rất ngắn so với PCR truyền thống (20 - 180 phút), Reltime PCR (3 - 4 giờ) và LAMP (45 - 60 phút), tùy thuộc vào kích thước đoạn gen đích. Ứng dụng thành cơng của công nghệ RPA đã được công bố nhiều trong thời gian gần đây. Công nghệ RPA đã được phát triển để phát hiện HIV, Rift Valley Fever virus, virus Ebola, Sudan và Marburg, MERS-CoV, virus gây bệnh chân tay miệng và Coronavirus ở bị. Bên cạnh đó, xét nghiệm này cũng đã được phát triển để phát hiện Chlamydia trachomatis trong các mẫu nước tiểu, chẩn đoán Cryptosporidiosis ở động vật và mẫu bệnh phẩm ở người và phát hiện Neisseria gonorrhoeae, Salmonella enterica, Staphylococcus aureus kháng methicillin (MRSA), Francisella tularensis, và Streptococci nhóm B. RPA tương tự với LAMP đều không cần đến máy luân nhiệt, tuy nhiên nhiệt độ tối ưu của RPA là 37°C trong khi của LAMP là 60°C. Ngồi ra, RPA có khả năng áp dụng multiplex dễ hơn LAMP vì RPA chỉ cần một cặp mồi trong khi LAMP cần tới ba cặp mồi. Sự có mặt của quá nhiều mồi trong phản ứng có thể dẫn đến tạo thành sản phẩm khơng đặc hiệu. Bên cạnh đó, các probe trong phản ứng RPA góp phần làm tăng tính đặc hiệu của xét nghiệm. Điều này đặc biệt quan trọng vì phản ứng LAMP có thể tạo ra sản phẩm khuếch
đại khơng đặc hiệu. Những ưu điểm này gợi ý rằng RPA có thể là lựa chọn tối ưu để áp dụng phát hiện acid nucleic chẩn đoán bệnh tại thực địa và hạn chế về nguồn lực [81], [93], [105].
Bên cạnh đó, độ nhạy và độ đặc hiệu của kỹ thuật RPA cũng rất cao. Các nghiên cứu cho thấy, cơng nghệ RPA có thể phát hiện được 1 bản sao của mẫu ADN đích (hoặc <10 bản sao của mẫu ARN) trong mẫu mà khơng cần địi hỏi q cao về độ tinh sạch của mẫu. Một số thử nghiệm cho thấy, RPA có thể xác định và nhân bản được đoạn acid nucleic mục tiêu trong mẫu chứa rất nhiều vật chất di truyền của các loài động vật khác nhau. Trong y tế, kỹ thuật này có thể được áp dụng một cách linh hoạt nhằm phát hiện trực tiếp và nhanh chóng một số mầm bệnh từ các mẫu bệnh phẩm như máu, dịch tiết, chất thải và tổ chức mô, trong khi hầu hết các phương pháp chẩn đoán hiện nay đều yêu cầu xử lý mẫu với kiềm yếu để giải phóng vật chất di truyền [58], [139].
Ngoài ra, việc áp dụng PCR để phát hiện tác nhân gây bệnh nói chung cũng địi hỏi phải thiết kế một mồi để bắt đầu sao chép ADN, do đó có thể hạn chế khả năng ứng dụng thực tế của kỹ thuật này để lấy mẫu thực địa. Realtime PCR có thể tiết kiệm đáng kể thời gian phát hiện nhưng lại đòi hỏi thiết bị tốn kém và thao tác thực hiện phức tạp. Gần đây, kỹ thuật LAMP cũng được ghi nhận với một số ưu điểm chính, như cho kết quả chẩn đốn nhanh, khuếch đại đẳng nhiệt, không cần điện di, độ nhạy lớn hơn nhiều so với PCR. Tuy nhiên, việc thiết kế mồi phức tạp và ít nhạy hơn đối với các mẫu phức tạp là những trở ngại chính để phổ biến LAMP [105].
Chính vì vậy, kỹ thuật RPA với việc có thể khắc phục một cách cơ bản nhược điểm của những kỹ thuật huyết thanh, sinh học phân tử khác đã trở thành một trong những phương pháp được quan tâm áp dụng hiện nay trong chẩn đoán và xác định bệnh trên nhiều đối tượng.
Chương 2:
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu một số đặc điểm nhiễm
Orientia tsutsugamushi, ấu trùng sốt mò tại khu vực Tây Bắc
2.1.1. Đối tượng, địa điểm, thời gian nghiên cứu
2.1.1.1. Đối tượng nghiên cứu
- Đối tượng nghiên cứu mầm bệnh sốt mò lưu hành tại cộng đồng: + Người dân tại điểm nghiên cứu, không phân biệt tuổi, giới. + Các loài chuột tại điểm nghiên cứu.
+ Trung gian truyền bệnh: ấu trùng mò. - Đối tượng nghiên cứu đặc điểm bệnh sốt mò:
+ Hệ thống sổ sách, bệnh án các trường hợp mắc bệnh sốt mò đến khám và điều trị tại các bệnh viện đa khoa 4 tỉnh từ ngày 01/01/2016 đến ngày 31/12/2017.
Tiêu chuẩn xác định bệnh [5]:
Dựa vào tiêu chuẩn lâm sàng và xét nghiệm: - Chỉ cần 1 tiêu chuẩn lâm sàng
+ Sốt, vết loét đặc trưng, có thể có hạch sưng đau, ban dát sẩn, bạch cầu 4.000 - 12.000, Lympho bình thường hoặc tăng, máu lắng tăng.
+ Chỉ tiêu bắt buộc: Phải có vết loét đặc trưng.
- Nếu khơng có vết lt đặc trưng, bắt buộc phải có một test sau đây dương tính:
+ Xét nghiệm hấp phụ miễn dịch gắn men (IgM ELISA) hoặc,
+ Xét nghiệm kháng thể miễn dịch huỳnh quang gián tiếp (IFA) hoặc, + Xét nghiệm kháng thể miễn dịch peroxidase gián tiếp (IIP).
+ Một số xét nghiệm khác như: Phân lập O. tsutsugamushi; Nhuộm soi kính hiển vi điện tử phát hiện vi khuẩn ở tế bào nuôi cấy; Xét nghiệm PCR.
2.1.1.2. Địa điểm nghiên cứu
- Nghiên cứu được triển khai tại 4 tỉnh thuộc khu vực Tây Bắc, gồm: Sơn La, Điện Biên, Lai Châu và Hịa Bình. Đây là những tỉnh có điều kiện sinh địa cảnh thuận lợi cho mò phát triển, điều kiện kinh tế - xã hội cịn nhiều khó khăn, vùng đồng bào dân tộc thiểu số, có ghi nhận số ca mắc bệnh sốt mò cao trong những năm trước đây và là vùng trọng điểm về chính trị, an ninh, quốc phịng.
- Viện Nghiên cứu Y - Dược học quân sự, Học viện Quân y.
2.1.1.3. Thời gian thực hiện
Nghiên cứu được thực hiện từ tháng 01 năm 2016 đến tháng 6 năm 2018.
2.1.2. Phương pháp nghiên cứu
2.1.2.1. Thiết kế nghiên cứu
- Nghiên cứu dịch tễ học mơ tả có phân tích.
- Nghiên cứu hồi cứu có phân tích đặc điểm bệnh sốt mị từ hồ sơ bệnh nhân sốt mò lưu tại 4 bệnh viện tuyến tỉnh.