TT Thành phần Ký hiệu Thể tích
1 Reaction Buffer A1, A2 600 µl
2 dNTPs B1, B2 100 µl 3 Probe E-mix C1, C2 120 µl 4 Nuclease-freewwater D1, D2 200 µl 5 Orientia tsutsugamushi oligo-mix I1, I2 100 µl 6 Exo E1, E2 22 µl
7 Core Reaction Mix F1, F2 60 µl
8 Positive Control G1, G2 100 µl
9 MgOAc H1, H2 100 µl
Bộ sinh phẩm Orientia tsutsugamushi RPA minikit được đóng gói
gồm 50 test/hộp. Tổng số 500 test đã được chế tạo.
Hình 3.9. Hình ảnh bộ sinh phẩm chẩn đốn Orientia tsutsugamushi
3.2.3.3. Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu, độ chính xác và độ lặp lại trong mỗi lần xét nghiệm và giữa các lần xét nghiệm của bộ kit
- Độ nhạy, độ đặc hiệu:
tích 37 mẫu bệnh phẩm dương tính (nhóm bệnh) và 100 mẫu bệnh phẩm âm tính (nhóm chứng).
Kết quả phát hiện thấy Orientia tsutsugamushi trong 36 mẫu bệnh phẩm dương tính, tương đương với độ nhạy của bộ kit phát hiện Orientia tsutsugamushi là 97,3% (36/37).
Trên nhóm chứng khỏe mạnh, kết quả khơng phát hiện thấy Orientia
tsutsugamushi trong 99 mẫu bệnh phẩm âm tính, tương ứng với độ đặc hiệu
của bộ kit phát hiện Orientia tsutsugamushi là 99% (99/100). - Độ chính xác:
Thử nghiệm phát hiện Orientia tsutsugamushi với kit phát hiện
Orientia tsutsugamushi lặp lại 3 lần trên 10 mẫu bệnh phẩm giả định. Trong
số 10 bệnh phẩm giả định thử nghiệm có 2 mẫu bệnh phẩm âm tính với
Orientia tsutsugamushi và 8 mẫu bệnh phẩm có chứa các hàm lượng Orientia tsutsugamushi khác nhau. Kết quả cho thấy bộ kit phát hiện Orientia tsutsugamushi phù hợp 100% với kết quả đã biết của 10 mẫu bệnh phẩm giả
định. Như vậy, bộ kit phát hiện Orientia tsutsugamushi có độ chính xác cao. - Độ lặp lại:
Hai kỹ thuật viên Viện nghiên cứu Y - Dược học quân sự, Học viện Quân y sử dụng kit phát hiện Orientia tsutsugamushi để phát hiện Orientia
tsutsugamushi trên 10 mẫu bệnh phẩm giả định. Trong đó, có 2 mẫu bệnh phẩm âm tính với Orientia tsutsugamushi và 8 mẫu bệnh phẩm có chứa các hàm lượng Orientia tsutsugamushi khác nhau từ 150 bản sao/phản ứng đến 145.000 bản sao/phản ứng. Kết quả cho thấy các mẫu có nồng độ ≥ 500 bản sao/phản ứng, độ lặp lại của bộ kit rất tốt thể hiện qua kết quả giống nhau trong 3 lần lặp lại được thực hiện bởi 1 người và so sánh giữa 2 người thực hiện. Các mẫu có nồng độ <500 bản sao/phản ứng có độ lặp lại thấp hơn. Như vậy, bộ kit phát hiện Orientia tsutsugamushi có độ lặp lại tốt.
3.2.3.4. Đánh giá độ ổn định của quy trình khuếch đại acid nucleic chẩn đốn Orientia tsutsugamushi trong máu của bệnh nhân sốt mị
Tính ổn định của bộ kit phát hiện Orientia tsutsugamushi được đánh giá dựa trên kết quả dương/âm tính và việc so sánh thời gian thu nhận được tín hiệu khuếch đại giữa các phản ứng sử dụng lô sản phẩm bảo quản và lô sản phẩm mới trên cùng một mẫu bệnh phẩm. bệnh phẩm sử dụng là bệnh phẩm thu thập ngay trước khi tiến hành thí nghiệm; lô sản phẩm mới được chuẩn bị ngay trước khi tiến hành thí nghiệm.
Bảng 3.24. Kết quả đánh giá độ ổn định của bộ kit dựa trên kết quả phát hiện Orientia tsutsugamushi trong mẫu bệnh phẩm
Thời gian bảo quản Kết quả XN của lô sản phẩm bảo quản
Kết quả XN của lô sản phẩm mới
7 ngày bảo quản + +
14 ngày bảo quản + +
30 ngày bảo quản + +
60 ngày bảo quản + +
90 ngày bảo quản + +
Nhận xét:
Kết quả cho thấy với cùng một mẫu bệnh phẩm được phân tích trên lơ sản phẩm đã qua bảo quản theo thời gian 7, 14, 30, 60 và 90 ngày cùng với lô sản phẩm mới, kết quả phát hiện Orientia tsutsugamushi trên mẫu bệnh phẩm sử dụng lô sản phẩm đã qua bảo quản trùng hợp 100% so với lô sản phẩm chuẩn bị mới.
Bảng 3.25. Kết quả đánh giá độ ổn định bộ kit dựa trên thời gian thu nhận được tín hiệu khuếch đại
Thời gian bảo quản
Kết quả thử nghiệm lô sản phẩm bảo quản
Kết quả thử nghiệm lô sản phẩm mới
7 ngày bảo quản 6,72 phút 6,59 phút
14 ngày bảo quản 6,49 phút 6,17 phút
30 ngày bảo quản 7,44 phút 6,59 phút
60 ngày bảo quản 7,45 phút 6,72 phút
90 ngày bảo quản 7,78 phút 6,77 phút
Nhận xét:
Thời gian thu nhận được tín hiệu khuếch đại sử dụng lơ sản phẩm đã qua bảo quản muộn hơn khi sử dụng lô sản phẩm mới chuẩn bị với thời gian chênh lệch trung bình là 36,48 giây. Như vậy bộ kit phát hiện Orientia tsutsugamushi có tính ổn định cho đến ít nhất 90 ngày trong điều kiện bảo
quản phù hợp (-200C).
3.2.3.5. So sánh với bộ kit khuếch đại acid nucleic chẩn đoán Orientia
tsutsugamushi của nước ngoài
Sử dụng Primerdesign genesig kit phát hiện Orientia tsutsugamushi
để tiến hành so sánh các thông số kỹ thuật với bộ kit đẳng nhiệt RPA phát hiện Orientia tsutsugamushi được chế tạo. Các thông số kỹ thuật được sử
dụng để so sánh bao gồm: độ nhạy và độ đặc hiệu, độ chính xác, độ lặp lại, độ tương hợp giữa hai bộ kit.
- Độ nhạy và độ đặc hiệu:
Sử dụng 2 bộ kit phát hiện Orientia tsutsugamushi (bộ kit đẳng nhiệt RPA và bộ kit Genesig) để phân tích 37 mẫu máu của bệnh nhân được chẩn đoán xác định trên lâm sàng là bệnh sốt mị thể thơng thường điển hình (nhóm bệnh) và 100 mẫu máu của người khỏe mạnh (nhóm chứng).