Chương 3 : KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.2. Kết quả nghiên cứu chế tạo bộ sinh phẩm phát hiện Orientia
3.2.1. Thiết kế phản ứng khuếch đại acid nucleic bằng các công nghệ
khác nhau để phát hiện Orientia tsutsugamushi
3.2.1.1. Tách dịng giải trình tự vùng gen bao ngồi đoạn gen đích dự định thiết kế primer/probe
Plasmid tái tổ hợp gồm trình tự gen đích 47 kDa đã được khuếch đại bằng PCR và vector tách dòng pJET1.2/blunt sau tách chiết được đánh giá trên hệ thống Nanodrop cho thấy độ tinh sạch cao với tỉ lệ A260/280 là 1,84 nằm trong khoảng giá trị cho phép (1,8-2,0) với nồng độ khá cao (20,1 ng/µl). Sản phẩm sau khi cắt bằng enzyme giới hạn BamHI được giải trình tự.
Hình 3.2. Hình ảnh đọc trình tự gen kiểm tra đoạn chèn
Sau khi giải trình tự và phân tích chuỗi gen, đã thu nhận được gen có độ dài khoảng 500 nucleotide. Chuỗi này được truy cập Ngân hàng gen bằng chương trình BLAST. Trình tự đoạn chèn có mức độ tương đồng cao (khoảng 98%) với trình tự gen 47 kDa mã truy cập L11697.1 đã công bố trong Ngân hàng gen. Chứng tỏ đoạn chèn thu nhận được đúng là gen 47 kDa. Như vậy, đã tạo thành công plasmid tái tổ hợp pJET1.2/47 kDa chứa trình tự gen 47 kDa dùng để thiết kế Primer/Probe.
3.2.1.2. Thiết kế primer và probe cho phản ứng khuếch đại acid nucleic
bằng các công nghệ khác nhau để chẩn đoán Orientia tsutsugamushi
Căn cứ các báo cáo về tính đa hình các gene của Orientia tsutsugamushi lưu hành trên thế giới và Việt Nam, chọn gene 47 kDa làm khuôn để thiết kế bộ công cụ primer/probe dùng cho các kỹ thuật trong đề tài. Các bộ primer/probe đều được đánh giá khả năng đặc hiệu và các thông số cần thiết bằng cơng cụ BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).
Bảng 3.15. Trình tự primer và probe khuếch đại acid nucleic sử dụng các công nghệ khác nhau
Công
nghệ Primer ADN sequence (5’-3’)
Realtime PCR Forward AACTGATTTTATTCAAACTAATGCTGCT Reverse TATGCCTGAGTAAGATACRTGAATRGAATT Probe 5′-FAM-TGGGTAGCTTTGGTGGACCGATGTTTAATCT-BHQ1-3′ RPA Forward TAAAGTTGCATGATGGTTCAGAACTGATAGCA Reverse TATTGCAATAACCTGATCTCCTACTCTAGA Probe 5’dATTAAAAATTAATTCTTCAGCAGCATTATCTTA-(FAM-dT)- GC-(THF)-AC-(BHQ1-dT)-TTTGGCGATTCA-3’ blocker
3.2.1.3. Thiết kế primer và probe cho phản ứng khuếch đại chứng nội
Tiến hành thiết kế thành công bộ primer/probe đặc hiệu với gen của người dùng làm chứng nội trong các phản ứng khuếch đại, với gen đích là β- globin trong huyết thanh người. Trình tự primer và probe cho phản ứng khuếch đại chứng nội được trình bày ở bảng sau:
Bảng 3.16. Trình tự primer/probe cho phản ứng khuếch đại chứng nội
Primer/Primer ADN sequence (5’-3’)
Primer
Forward 5′-GTG CAC CTG ACT CCT GAG GAG A-3′
Reverse 5′-CCT TGA TAC CAA CCT GCC CAG-3′
Probe 5′-(FAM)AAG GTG AAC GTG GAT GAA GTT GGT GG (BHQ1)-3′
Các primer và probe đặc hiệu cho vùng gen đích β-globin đã được kiểm tra sự bắt cặp đặc hiệu bằng công cụ BLAST, kết quả cho thấy sự bắt cặp rất tốt.