CHƯƠNG 2 : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. Nội dung và phương pháp nghiên cứu
2.3.2. Bố trí thí nghiệm
2.3.2.1. Khảo sát các đặc điểm sinh học, định danh chủng LAB L5
Hình 2.2. Quy trình khảo sát đặc điểm sinh học, định danh chủng LAB L5 a. Mục đích a. Mục đích
Khảo sát nhằm khẳng định lại chủng vi khuẩn là chủng lactic và tính thuần khiết của chúng, từ đó tiến hành định danh cấp lồi.
Chủng LAB L5
Tăng sinh trong MRS broth 370C, 24h
Cấy chuyền sang MRS agar 370C, 48h
Khảo sát đặc điểm sinh lý, sinh hóa
Giải trình tự gen 16S rRNA
Định danh cấp lồi
Quan sát hình thái khuẩn lạc
- Nhuộm Gram
- Thử nghiệm catalase - Thử nghiệm khả năng
b. Thuyết minh quy trình
Chủng LAB L5 được hoạt hóa và tăng sinh trong MRS broth đã được hấp khử trùng ở 1210C trong 15 phút, đem ủ ở 370C trong 24h. Sau đó, tiến hành cấy chuyền sang MRS agar, ủ ở 370C trong 48h. Tiến hành quan sát hình thái khuẩn lạc và khảo sát các đặc điểm sinh lý sinh hóa của chủng vi khuẩn bằng các phương pháp:
- Nhuộm Gram;
- Thử nghiệm catalase;
- Thử nghiệm khả năng lên men đường.
Sau khi đã khẳng định chủng LAB và tính thuần khiết, chủng vi khuẩn được gửi đi để tiến hành định danh cấp lồi bởi cơng ty Nam Khoa Biotek.
2.3.2.2. Khảo sát môi trường ni cấy thích hợp nhất thay thế MRS
Mơi trường được lựa chọn để khảo sát thay thế cho MRS là môi trường Sữa gầy (SG) với các nồng độ glucose khác nhau (SG0, SG3, SG7) (mục 1.5, phụ lục 1).
Các thí nghiệm so sánh các chỉ tiêu giữa môi trường MRS với các môi trường SG0, SG3, SG7 được thực hiện đồng thời với mật độ cấy giống ban đầu (106 cfu/ml), điều kiện và thời gian nuôi cấy như nhau. Các chỉ tiêu so sánh gồm: khả năng kháng nấm in vitro, khả năng thu sinh khối, khả năng sinh acid và khả năng phân giải protein.
a. Thí nghiệm 1: Khảo sát khả năng thu sinh khối
Thí nghiệm thực hiện theo quy trình hình 2.3. Xây dựng đường chuẩn tế bào trên môi trường MRS và môi trường SG. Chủng L5 sau tăng sinh 24h trong môi trường MRS và SG, được đo OD 600 nm và trải đĩa trên MRS agar đồng thời từ một huyền phù vi khuẩn, ủ 370C trong 48h, tiến hành đếm khuẩn lạc. Đường chuẩn là đồ thị biểu diễn OD 600 nm phụ thuộc vào mật độ vi khuẩn cfu/ml.
Hình 2.3. Quy trình dựng đường chuẩn tế bào LAB L5 b. Thí nghiệm 2: Khảo sát khả năng kháng nấm in vitro b. Thí nghiệm 2: Khảo sát khả năng kháng nấm in vitro
Môi trường sử dụng khảo sát đối kháng là MRS agar cải tiến (không chứa ammonium citrate). Quy trình khảo sát khả năng kháng nấm in vitro được trình bày trong hình 2.4. Tiến hành đo đường kính ức chế nấm sau 2 và 5 ngày.
Chủng LAB L5
Tăng sinh trong môi trường MRS broth và SG
Đo OD600nm Cấy trang trên MRS agar
Đếm khuẩn lạc Đường chuẩn Ủ 370C, 24h Ủ 370C, 24h Ủ 370C, 48h
Hình 2.4. Quy trình khảo sát khả năng kháng nấm in vitro
Chủng LAB L5
Hoạt hóa trên MRS broth
Tăng sinh trên MRS broth và SG
Chủng nấm mốc
Hoạt hóa trên mơi trường PDA
Cấy mốc vào đĩa petri chứa MRS
Đối chứng âm Ria 2 đường
chủng LAB L5 Ủ 72h ở nhiệt độ phịng Đo đường kính ức chế nấm Tỉ lệ ức chế nấm Đặt thạch nấm Đặt thạch nấm
c. Thí nghiệm 3: Khảo sát khả năng sinh acid
Thí nghiệm được thực hiện như hình 2.5
Hình 2.5. Quy trình khảo sát khả năng sinh acid của chủng LAB L5 d. Thí nghiệm 4: Khảo sát khả năng phân giải protein d. Thí nghiệm 4: Khảo sát khả năng phân giải protein
Hoạt tính protease được phân tích bán định lượng khuếch tán trong giếng thạch môi trường casein với thuốc thử TCA 10% (phương pháp Egorow NX, 1976)
2.3.2.3. Khảo sát so sánh giữa các loại bánh mì bở sung LAB với bánh mì thường và bánh mì bở sung chất bảo quản hóa học calcium propionate
Thí nghiệm nhằm so sánh các chỉ số theo dõi và độ yêu thích giữa các sản phẩm bánh mì. Bánh mì được làm theo quy trình hình 2.6, các sản phẩm bánh mì sau đó được đem đi khảo sát so sánh các chỉ tiêu về pH, khối lượng, thể tích, nấm mốc và cảm quan.
Chủng LAB L5
Tăng sinh trong MRS broth
Cấy chuyển sang MRS broth và SG
Dịch sau tăng sinh (10ml)
Chuẩn độ bằng NaOH 0,1N
Khả năng sinh acid
Hình 2.6. Quy trình làm bánh mì
Nhào bột
(1000 vịng/phút trong 13 phút) LAB
Lên men ổn định sơ bộ (30 phút ở nhiệt độ phòng) Nguyên liệu Chia bột (50g/phần) Vê bột (hình cầu) Lên men kết thúc (400C/ 40 phút) Nướng (1700C/ 13 phút) Đánh giá cảm quan và theo dõi các chỉ tiêu: - pH
- Khối lượng - Thể tích - Nấm mốc Bánh mì
Ngun liệu
Bột mì số 11 200 gr
Men 2,5 gr
Đường 30 gr
Sữa tươi không đường 135 ml
Bơ Zelachi 15 gr
Trứng gà ẵ trng
Mui 2 gr
Vani ắ ống
Đối với bánh mì bổ sung LAB: chủng LAB L5 được cấy đồng nhất 5% vào môi trường sữa gầy, tăng sinh sau 24h ở nhiệt độ phòng và lắc 150 vịng/phút. Với 135ml dịch ni cấy phối trộn với công thức như trên thay cho sữa tươi không đường.
Thuyết minh quy trình:
Hỗn hợp gồm bột mì, men, đường, muối được trộn trước để đảm bảo sự phân bố đều các hạt khơ trong bột mì. Sau đó trộn bơ, sữa, trứng và vani (bơ đã được làm tan chảy và sữa đã được gia nhiệt đến 800C). Sau khi trộn, đậy kín hỗn hợp trong 10 phút để tạo điều kiện cho độ ẩm có thể phân tán hết khối bột.
Đem hỗn hợp nguyên liệu khuấy trộn trong máy trộn bột vận tốc 1000 vòng/phút trong 13 phút, sau đó để bột nghỉ 30 phút ở nhiệt độ phòng. Tiến hành chia bột thành những khối hình cầu khối lượng 50g, lên men thời gian nhất định trong 40 phút ở 400C. Đem nướng trong lò với nhiệt độ 1700C trong 13 phút. Bánh thành phẩm được làm nguội ở nhiệt độ phịng và đem phân tích các chỉ tiêu về pH, thể tích, khối lượng, cảm quan và nấm mốc.
2.3.2.4. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian và điều kiện bảo quản lên giống khởi động và chất lượng bánh mì sử dụng giống khởi động
a. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian và điều kiện bảo quản lên mật độ giống khởi động
Hình 2.7. Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng của thời gian và điều kiện bảo quản lên mật độ
giống khởi động
Chủng LAB L5 tăng sinh trong MRS broth, được cấy đồng nhất 106 cfu/ml vào mơi trường SG thích hợp đã được hấp khử trùng 1210C trong 15 phút, lắc 150 vòng/phút ở nhiệt độ phòng. Sau 24h dịch tăng sinh được đem đi bảo quản trong tủ lạnh ở điều kiện lạnh và lạnh đông. Sau mỗi 1 tuần, 2 tuần, 3 tuần, 4 tuần bảo quản lấy ra đem cấy trang đếm mật độ khuẩn lạc của các dịch tăng sinh xác định được thời gian bảo quản tốt nhất của LAB L5 trong các loại môi trường.
b. So sánh các sản phẩm bánh mì được sản xuất từ giống khởi động sau thời gian bảo quản
Bánh mì được làm theo quy trình hình 2.6, mục 2.3.2.3. Bánh mì sau khi nướng được đem đi đánh giá cảm quan để kiểm tra mức độ ưa thích và mang đi khảo sát các chỉ tiêu về pH, khối lượng, thể tích, độ ẩm và nấm mốc.
2.3.2.5. Đề xuất quy trình sản xuất giống khởi động và bánh mì làm từ giống khởi động.
Dựa trên các kết quả thí nghiệm đạt được, đề xuất 2 quy trình: Chủng LAB L5
Cấy đồng nhất 106 vào SG0, SG7
Bảo quản ở điều kiện lạnh (40C) và lạnh đông (-180C)
Cấy trang đếm mật độ
Thời gian bảo quản tốt nhất
1). Quy trình sản xuất giống khởi động L. plantarum L5 trong môi trường Sữa gầy; 2). Quy trình sản xuất bánh mì làm từ giống khởi động.