1.2.5. Chuyển hóa các hợp chất nito ở LAB trong bánh mì bột nhào chua
Người ta đã xác định rằng để tăng trưởng tốt LAB cần từ 4 – 14 amino acid, do đó sự tăng trưởng của LAB phụ thuộc vào hệ thống phân giải protein của chúng. Hệ thống phân giải protein của LAB gồm một serine-protease ngoại bào, các hệ thống vận chuyển chuyên biệt cho di/tri-peptide, oligopeptide và vô số peptidase nội bào. Các enzyme phân giải protein được chia thành 2 nhóm: protease và peptidase. Protease xúc tác sự phân giải protein thành các peptide nhỏ hơn; peptidase thủy phân các liên kết peptide cụ thể hoặc phân giải hoàn toàn peptide thành acid amin. Hoạt động phân giải protein của bột mì chủ yếu là do các protease aspartic và carboxypeptidase trong điều kiện acid (bảng 1.2).
Bảng 1.2. Các nhóm protease chính của hạt lúa mì [7] Bột mì Bột mì
Nhóm protease Aspartic protease Serine carboxypeptidase II
Bản chất Enzyme nội bào Enzyme nội bào
pH hoạt động 3 – 4,5 4 – 6
Tính đặc hiệu Ngăn cách giữa các acid amin kỵ nước Giải phóng các acid amin thơm Hoạt động chống
lại gluten protein (+), Glutenin Hoạt động cùng protease
Người ta quan sát thấy rằng sự phân giải protein ở một mức độ vừa phải trong tất cả các quá trình lên men bột chua giúp cải thiện hương vị bánh mì mà khơng gây ảnh hưởng xấu đến kết cấu và khối lượng. Acid amin là tiền chất quan trọng của các hợp chất hương vị dễ bay hơi, đóng vai trị như chất nền cho sự chuyển đổi của VSV hoặc chuyển đổi thành các hợp chất hương vị trong quá trình nướng.
Ảnh hưởng của q trình acid hóa và của các protease lúa mì nội sinh ở pH 3 – 4 được coi là quan trọng đối với quá trình phân giải protein trong bột nhào, đặc biệt đối với quá trình lên men bột chua truyền thống. Acid hóa VSV và giảm liên kết disulfide trong gluten bởi Lactobacillus spp. lên men dị hình làm tăng độ hịa tan của gluten làm cho gluten dễ bị phân hủy hơn. Các acid amin được tạo ra bởi sự thủy phân peptide trong bột chua phụ thuộc vào chủng Lactobacillus spp., trong khi nấm
men làm giảm acid amin trong bột nhào. Các hoạt động trao đổi chất trong quá trình phân giải protein được mơ tả trong hình 1.3 và 1.4.
Hình 1.3. Vai trị của LAB vào q trình phân giải protein trong bột chua
1.2.6. Các loại hợp chất hương trong bột chua
Quá trình lên men bột chua là yếu tố quan trọng trong việc tạo ra mùi vị cho bánh mì [36]. Các hoạt động trao đổi chất kết hợp của các VSV, tạo ra sự acid hóa hoặc tạo chua có ảnh hưởng đến đặc tính của bánh mì đặc biệt là kết cấu, thời hạn sử dụng [6] và tạo ra các thành phần hương vị điển hình mang lại đặc điểm cảm quan chua đặc trưng [14, 19].
Trong q trình lên men có hai loại hợp chất hương vị được sản xuất: một là hợp chất không bay hơi bao gồm acid hữu cơ (chủ yếu là acid lactic và có thể là acid acetic) được sản xuất bởi vi khuẩn đồng hình và dị hình làm acid hóa, giảm độ pH và góp phần tạo hương vị cho bột nhào [5, 13]; hai là các hợp chất dễ bay hơi chứa rượu, aldehyde, ketone, este và lưu huỳnh. Các hợp chất bay hơi được tạo ra bởi quá trình lên men nấm men là 2-metyl-1-propanol; 2,3 methyl-1-butanol và các iso-alcohol khác. LAB lên men dị hình tạo ra nhiều ethyl acetate, một số alcohol và aldehyde, trong khi đó LAB lên men đồng hình lại sinh ra nhiều diacetyl và các hợp chất có nhóm carbonyl. Hai lồi sinh ra các hợp chất hương vị thích hợp nhất trong bánh mì bột chua là L. brevis subsp. Lindneri và L. plantarum. Hầu hết các LAB đều cải thiện sự tạo hương của nấm men.
1.2.7. Vai trò và ảnh hưởng của chất bảo quản trong sản xuất bánh mì
Bánh mì là một trong những loại thực phẩm được sản xuất và tiêu thụ rộng rãi, tuy nhiên các sản phẩm bánh mì có thời hạn sử dụng ngắn dẫn đến sự tổn thất đáng kể về kinh tế và gây lãng phí. Nguyên nhân chính gây nên vấn đề trên chủ yếu là do sự phát triển của VSV, đặc biệt là nấm mốc (bảng 1.3). Để ngăn chặn điều này, các nhà sản xuất đã thêm vào trong q trình sản xuất các hóa chất bảo quản, chủ yếu là các acid yếu và muối của chúng (propionic, benzoic, sorbic, …). Trong đó, calcium propionate là hóa chất bảo quản được sử dụng rộng rãi trong sản xuất bánh mì với ngưỡng nồng độ cho phép nhỏ hơn 0,3%.
Bảng 1.3. Một số hư hỏng của bánh mì do vi sinh vật gây ra
Biểu hiện của hư hỏng Nguyên nhân
Mốc bánh mì Do tạp nhiễm các bào tử nấm mốc và điều kiện bảo quản khơng đảm bảo.
Ruột bánh mì bi ̣đỏ
Do một số vi khuẩn và nấm sinh sắc tố phát triển trong ruột bánh mì làm cho ruột bánh mì có màu đỏ (thường do vi khuẩn Bacillus prodigiosum). Bệnh này không
nguy hiểm đối với người. Ruột bánh mì bị nhớt
Do vi khuẩn Bacillus spp. gây ra, khi phát triển vi khuẩn sẽ tiết ra protease thủy phân protein làm ruột bánh mì bị dính nhớt, thẫm màu và có mùi khó chịu.
Bệnh say bánh mì
Do nấm Fusarium sporotrichioides gây ra, có nguồn gốc từ hạt lúa mì ở những cây có nấm này ký sinh trên đồng ruộng. Nấm này chịu nhiệt cao và không bi ̣tiêu diệt khi nướng bánh. Khi nấm phát triển trên bánh mì chúng ta không thấy dấu hiệu hư rõ rệt nhưng làm cho người khi ăn phải bị ngộ độc và có cảm giác ngất ngây như say rượu do độc tố chúng tiết ra.
Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu đã chỉ ra những tác hại không mong muốn khi sử dụng calcium propionate:
- Một nghiên cứu ở 27 trẻ em của Dengate và Ruben, 2002 [12] cho thấy một số trẻ bị kích thích, bồn chồn, kém chú ý và khó ngủ sau khi tiêu thụ bánh mì có chứa calcium propionate hàng ngày.
- Ở nồng độ 4%, acid propionic gây ra sự xuất hiện của các khối u ở chuột [32]. - Muhialdin, Hassan và cộng sự, 2013 [28] đã chỉ ra việc sử dụng calcium
propionate tiềm ẩn nguy cơ phát triển nấm có tính kháng thuốc.
- Trong một số trường hợp, calcium propionate có thể gây ra các cơn đau đầu hoặc đau nửa đầu [33].
- Một nghiên cứu trên cơ thể người cho thấy có mối liên hệ giữa hàm lượng propionate sử dụng với tình trạng kháng insulin dẫn đến bệnh tiểu đường loại 2 [41].
Chính vì những tác dụng khơng mong muốn do chất bảo quản hóa học mang lại, nhu cầu tìm kiếm nguồn bảo quản sinh học ngày càng được quan tâm và phát triển nhằm thay thế cho chất bảo quản hóa học.
1.3. Tổng quan về vi khuẩn lactic
Thuật ngữ LAB (Lactic Acid Bacteria) được dùng để mơ tả nhóm vi khuẩn gram dương, hình que hoặc hình cầu, có chung các đặc điểm sinh lý và đặc điểm trao đổi chất. Các vi khuẩn này được tìm thấy nhiều ở thực vật, đặc biệt là cỏ khô và các sản phẩm từ sữa, ngồi ra chúng cịn được tìm thấy trong ruột, khoang miệng người và động vật.
LAB được tách lần đầu tiên từ sữa bị lên men chua bởi nhà hóa học người Thụy Điển Scheele vào năm 1780. Năm 1875, Louis Pasteur đã chứng minh được việc làm sữa chua là kết quả hoạt động của một nhóm VSV đặc biệt. Năm 1878, Lister đã phân lập thành công LAB và đặt tên là Bacterium lactic (ngày nay gọi là Streptococcus lactic). Đến 1881, ngành công nghiệp lên men nhờ LAB đã được hình thành.
Phân loại khoa học (theo khóa phân loại Bergey): - Giới: Vi khuẩn - Ngành: Firmicutes - Lớp: Bacilli - Bộ: Lactobacillales - Họ: Lactobacillacea - Chi: Lactobacillus
Hình 1.5. Hình ảnh vi khuẩn lactic dưới kính hiển vi
1.3.1. Đặc điểm sinh học của vi khuẩn lactic
LAB thuộc vi khuẩn Gram (+), không di động, không sinh bào tử, hô hấp tùy nghi, không chứa cytochrom và catalase, trao đổi chất bằng con đường lên men, sinh sản bằng hình thức phân đơi tế bào. Ngồi sản phẩm chính là acid lactic, LAB cịn sản sinh ra acid acetic, ethanol, các hợp chất thơm, bacteriocin, exopolysaccharide và một số enzyme quan trọng khác [9]. LAB có thể lên men các loại đường đơn, một số chủng có thể lên men đường đôi, không lên men được tinh bột (trừ chủng
Lactobacillus delbruceckii) và các loại polysaccharide khác.
LAB có kích thước thay đổi tùy lồi, và có nhiều hình dạng khác nhau: trực khuẩn hình cầu hoặc hình que ngắn hoặc dài, ở dạng đơn, đôi, hoặc xếp thành chuỗi. Khuẩn lạc LAB dạng hình trịn, lồi, có màu mơi trường, trắng đục hoặc vàng kem, đặc biệt khuẩn lạc tỏa ra mùi chua của acid.
Việc phân loại LAB thành các chi khác nhau chủ yếu dựa vào hình thái, con đường lên men glucose, sự tăng trưởng ở các nhiệt độ khác nhau, cấu hình của acid lactic được sản xuất, khả năng phát triển ở nồng độ muối cao và khả năng chịu acid hoặc kiềm [34].
Theo khóa phân loại của Bergey, LAB được xếp vào họ Lactobacillaceae, bao gồm nhiều chi khác nhau, trong đó các chi Streptococcus spp., Pediococcus spp.,
Lactobacillus spp., Leuconostoc spp. được mô tả và nghiên cứu nhiều nhất.
- Chi Streptococcus spp. có dạng hình trịn hoặc hình ovan, đường kính tế bào 0,5-1µm. Sau khi phân chia theo một phương, chúng thường xếp riêng biệt, cặp đôi hoặc chuỗi ngắn.
- Chi Leuconostoc spp. có hình dạng hơi dài hoặc hình ovan, đường kính từ
0,5 – 0,8 µm và chiều dài khoảng 1,6 µm. Trong một số điều kiện chúng cũng có dạng hơi trịn, chiều dài khoảng 1 – 3 µm. Sau khi phân chia chúng thường sắp xếp thành chuỗi, không tạo thành đám tập trung.
- Chi Pedicoccus spp. là những tứ cầu khuẩn hoặc song cầu khuẩn, có hoạt tính thủy phân protein rất yếu.
- Chi Lactobacillus spp. hiện gồm hơn 125 lồi, có dạng hình que, tùy vào điều kiện của mơi trường sống mà hình dạng của chúng thay đổi từ hình que ngắn đến dài, xếp thành chuỗi hay đứng riêng lẻ.
1.3.2. Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic
LAB là những vi sinh vật có yêu cầu dinh dưỡng cao, tùy thuộc loài LAB cụ thể mà nhu cầu dinh dưỡng khác nhau. Để sinh trưởng bình thường ngồi nhu cầu về các nguồn cơ chất chứa các nguyên tố cơ bản như carbon, nitơ (một phần dưới dạng các amino acid), phosphate, lưu huỳnh, LAB cịn có nhu cầu về vitamin, các chất sinh trưởng và chất khoáng.
1.3.2.1. Nhu cầu dinh dưỡng carbon
LAB có thể sử dụng được nhiều loại carbohydrate, nguồn carbon này được LAB sử dụng để cung cấp năng lượng, xây dựng cấu trúc tế bào và làm cơ chất cho quá trình lên men tổng hợp các acid hữu cơ như acid lactic, acid acetic, acid citric, pyruvic, fumaric,.. tùy vào lồi LAB lên men đồng hình hay dị hình.
1.3.2.2. Nhu cầu dinh dưỡng nitơ
Phần lớn LAB không thể sinh tổng hợp được các chất hữu cơ phức tạp có chứa nitơ, vì vậy để đảm bảo cho sự sinh trưởng và phát triển LAB phải sử dụng các nguồn
nitơ có sẵn trong mơi trường. Các nguồn nitơ LAB có thể sử dụng là cao thịt, cao nấm men, trypton, dịch thủy phân casein từ sữa, pepton, ... trong đó cao nấm men là nguồn nitơ được sử dụng nhiều nhất và có hiệu quả nhất, tuy nhiên ở quy mô công nghiệp người ta không sử dụng nguồn nitơ này vì rất tốn kém.
1.3.2.3. Nhu cầu về vitamin
Vitamin đóng vai trị là các coenzyme trong quá trình trao đổi chất của tế bào nên rất cần thiết cho hoạt động sống. Tuy nhiên, đa số các lồi LAB khơng có khả năng sinh tổng hợp vitamin, vì vậy trong các mơi trường ni cấy LAB cần bổ sung thêm các loại vitamin. Các chất chứa vitamin thường sử dụng như nước chiết từ khoai tây, ngô, cà rốt hay dịch tự phân nấm men.
1.3.2.4. Nhu cầu các chất hữu cơ khác
Ngồi các acid amin và vitamin, LAB cịn cần các hợp chất hữu cơ khác cho sự phát triển như các bazơ nitơ hay các acid hữu cơ. Một số acid hữu cơ có ảnh hưởng tích cực đến tốc độ sinh trưởng của LAB như acid citric hoặc acid oleic, nên hiện nay người ta sử dụng các muối citrate hoặc dẫn xuất của acid oleic làm thành phần môi trường nuôi cấy, phân lập và bảo quản các chủng LAB. Tương tự như hai acid hữu cơ trên, acid acetic cũng có những tác động quan trọng đến sự sinh trưởng của tế bào nên người ta thường sử dụng acid acetic dưới dạng các muối acetat để làm chất đệm cho môi trường khi nuôi cấy LAB.
1.3.2.5. Nhu cầu các muối vô cơ khác
LAB rất cần các muối vô cơ cho sự sinh trưởng và phát triển. Các muối vô cơ cung cấp các nguyên tố khoáng như đồng, sắt, natri, kali, photpho, lưu huỳnh, magie, mangan, … trong đó magie và mangan có vai trị quan trọng trong việc tham gia và đảm bảo chức năng hoạt động của enzyme, giúp ngăn ngừa quá trình tự phân và ổn định cấu trúc tế bào.
1.3.2.6. Nhu cầu dinh dưỡng oxy
LAB vừa có khả năng sống được trong mơi trường có oxy, vừa sống được trong mơi trường khơng có oxy. Tuy nhiên, trong điều kiện hiếu khí, sinh khối vi khuẩn sẽ phát triển nhanh hơn so với trong điều kiện kị khí.
1.3.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men – quá trình sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn lactic triển của vi khuẩn lactic
Trong công nghiệp, vật liệu dùng để làm môi trường cho vi sinh vật phát triển cần đảm bảo các yếu tố: đầy đủ chất dinh dưỡng, khơng có độc tố, cho hiệu suất thu hồi là lớn nhất và giá thành rẻ. Mỗi nguồn dinh dưỡng cung cấp không chỉ ảnh hưởng đến sự phát triển của vi khuẩn trong quá trình ni cấy mà cịn ảnh hưởng khơng nhỏ đến quá trình thu hồi và bảo quản chế phẩm sinh khối sau này.
1.3.3.1. Thành phần môi trường nuôi cấy
LAB thuộc loại vi sinh vật dị dưỡng. Nguồn năng lượng cần thiết cho hoạt động sống và phát triển của LAB là nguồn năng lượng do trao đổi chất với môi trường bên ngồi. Thành phần mơi trường và tạp nhiễm cũng ảnh hưởng đến q trình ni cấy LAB. Ngồi ra, để duy trì sự sống, điều hịa các q trình chuyển hóa trong tế bào, LAB cần sử dụng nguồn glucide có trong mơi trường dinh dưỡng làm nguồn carbon, nguồn nitơ (pepton, acid amin), vitamin, muối khống và các yếu tố vi lượng. Vì vậy, cần bổ sung các nguồn dinh dưỡng trên với liều lượng thích hợp nhất giúp LAB phát triển tốt, nâng cao hiệu suất lên men.
1.3.3.2. Yếu tố môi trường
Điều kiện môi trường nuôi cấy khác nhau ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng, phát triển cũng như quá trình trao đổi chất của LAB, đặc biệt là khả năng sản sinh ra hợp chất kháng khuẩn.
a. Ảnh hưởng của nhiệt độ
Cũng giống như các sinh vật khác, nhiệt độ môi trường cũng ảnh hưởng rất lớn đối với VSV. Khi nhiệt độ nuôi cấy quá cao hay quá thấp đều có thể gây ức chế các enzyme, làm đình trệ các phản ứng trao đổi chất, gây ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn. Nhiệt độ càng cao thì sự lên men càng mạnh. Phần lớn LAB sinh trưởng tốt nhất ở nhiệt độ 30 – 400C, một số có thể sinh trưởng dưới 150C và thậm chí một số dịng có thể sinh trưởng dưới 50C.
LAB nói chung có thể phát triển được trong môi trường acid, pH có thể từ 4,5 – 8,5. Trong quá trình lên men, vi khuẩn sẽ sinh ra acid lactic, khi pH thấp hơn 4 LAB sẽ ức chế các vi khuẩn tạp nhiễm, tuy nhiên cũng ức chế sự phát triển của chính nó, do đó cần phải theo dõi suốt q trình lên men, dùng bazơ để điều chỉnh về pH thích hợp.
c. VSV tạp nhiễm trong quá trình lên men
Hệ VSV tạp nhiễm thường ảnh hưởng xấu đến quá trình lên men, ở những mức độ khác nhau có thể phá hủy các tế bào giống hoặc phá vỡ tế bào, ảnh hưởng đến quá