Phần 3 Vật liệu và phƣơng pháp nghiên cứu
3.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
3.2.1. Thời gian nghiên cứu
Từ năm 2015 đến 2018.
3.2.2. Địa điểm nghiên cứu
- Các trang trại chăn nuôi vịt Cổ Lũng tại huyện Bá Thước, tỉnh Thanh Hóa; - Trung tâm nghiên cứu Vịt Đại Xuyên, huyện Phú Xuyên, thành phố Hà Nội; - Phịng thí nghiệm Bộ mơn Nội - Chẩn - Dược - Độc chất, Khoa Thú Y; phịng thí nghiệm Trung tâm; phịng thí nghiệm Bộ mơn di truyền giống, Khoa Chăn nuôi - Học viện Nông nghiệp Việt Nam, thị trấn Trâu Quỳ, huyện Gia Lâm, thành phố Hà Nội;
- Phịng Cơng nghệ ADN ứng dụng, viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam.
3.3. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3.1. Khảo sát số lượng, sự phân bố và một số đặc điểm sinh học của vịt Cổ Lũng Cổ Lũng
3.3.1.1. Điều tra số lượng, sự phân bố và khảo sát đặc điểm ngoại hình
- Số lượng, sự phân bố vịt Cổ Lũng được nghiên cứu bằng phương pháp điều tra, khảo sát với bộ câu hỏi được thiết kế trước và các dữ liệu thứ cấp thu được từ Chi cục thống kê huyện Bá Thước. Tổng số 124 hộ có chăn ni vịt Cổ Lũng tại 6 xã khu vực Quốc Thành, huyện Bá Thước được chọn để thu thập thông tin về thực trạng chăn nuôi vịt Cổ Lũng bằng phiếu điều tra.
- Đàn vịt Cổ Lũng thế hệ xuất phát gồm 360 con, được chọn lọc nghiêm ngặt tại các nông hộ thuộc huyện Bá Thước, tỉnh Thanh Hóa, sau đó đưa về chăn
nuôi, nhân thuần tại Trung tâm nghiên cứu Vịt Đại Xuyên đến thế hệ thứ 3. Vịt được ni theo nhóm quần thể nhỏ, sau mỗi thế hệ, các cá thể trống mái trong các đàn được luân chuyển khi ghép đàn để tránh cận huyết.
Đặc điểm ngoại hình, kích thước các chiều đo và một số đặc điểm sinh học của vịt Cổ Lũng được xác định trên đàn vịt Cổ lũng hạt nhân thế hệ thứ ba, gồm 540 cá thể vịt con mới nở nuôi tại Trung tâm Nghiên cứu Vịt Đại Xuyên.
+ Mô tả một số đặc trưng chủ yếu về ngoại hình của vịt Cổ Lũng bao gồm màu lông, da, mỏ, chân, cấu trúc cơ thể… bằng các phương pháp quan sát, chụp ảnh, mơ tả, ghi chép các đặc điểm ngoại hình của vịt tại một số thời điểm sinh trưởng: 1 ngày tuổi và vịt trưởng thành.
+ Đo kích thước các chiều đo của vịt Cổ Lũng tại các thời điểm 8 tuần tuổi và 38 tuần tuổi. Mỗi lần đo tối thiểu 30 cá thể vịt trống và 30 cá thể vịt mái. Các chiều đo bao gồm:
Chiều dài thân (cm): đo bằng thước dây, từ đốt xương cổ cuối cùng đến đốt xương đi đầu tiên;
Vịng ngực (cm): đo bằng thước dây vòng quanh ngực, sát gốc cánh phía dưới;
Chiều dài lườn (cm): đo bằng thước dây, từ điểm đầu đến điểm cuối của xương lưỡi hái;
Cao chân (cm): đo bằng thước thẳng, từ khớp khuỷu chân đến đệm bàn chân; Dài lông cánh (cm): đo bằng thước thẳng, đo lông cánh thứ tư của hàng lơng thứ nhất.
3.3.1.2. Phân tích các chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa máu vịt
Các chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa máu được phân tích từ 60 mẫu máu được lấy từ 60 cá thể vịt Cổ Lũng ở thế hệ thứ 3 tại Trung tâm nghiên cứu Vịt Đại Xuyên (gồm 30 vịt trống và 30 vịt mái) được lấy ở tĩnh mạch cánh vào lúc sáng sớm khi chưa cho ăn tại thời điểm 8 tuần tuổi để phân tích một số chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa máu của vịt. Mỗi con lấy 2ml cho vào ống chứa máu chuyên dụng (có chứa sẵn 0,1 ml chất chống đơng máu EDTA) để phân tích các chỉ tiêu sinh lý và 2 ml được cho vào ống tách huyết thanh (khơng có chất chống đông) dùng để tách huyết thanh cho phân tích các chỉ tiêu sinh hóa. Các mẫu máu xét nghiệm của
mỗi con đều được đánh số, bảo quản trong bình bảo ơn chun dụng ở nhiệt độ
từ 2 đến 80C sau đó vận chuyển về Phịng thí nghiệm Bộ mơn Nội - Chẩn - Dược
- Độc chất, Khoa Thú Y, Học Viện Nơng Nghiệp Việt Nam để phân tích các chỉ tiêu sinh lý và sinh hóa máu.
- Phân tích các chỉ tiêu sinh lý máu, bao gồm: số lượng hồng cầu có trong
1mm3 máu (RBC); số gam hemoglobin có trong 1 dL máu (Hb); dung tích hồng
cầu (HCT); số lượng tiểu cầu (PLT); thể tích trung bình của hồng cầu (MCV); lượng hemoglobin trung bình trong một hồng cầu (MCH); nồng độ hemoglobin trung bình (MCHC). Cơng thức bạch cầu: tổng số bạch cầu (WBC); bạch cầu đa nhân trung tính (neutrophils); bạch cầu ái toan (eosinophil); bạch cầu ái kiềm (basophil); lâm ba cầu (lymphocyte); bạch cầu đơn nhân lớn (monocyte) được phân tích bằng máy huyết học 18 thông số: model Hema screen 18 của hãng Hospitex do Italy sản xuất.
- Phân tích các chỉ tiêu sinh hóa máu, bao gồm: hàm lượng protein tổng số (g/l), albumin và các tiều phần protein huyết thanh: α1 - globulin (g/l), α2 - globulin (g/l), β - globulin (g/l) và γ - globulin (g/l) được phân tích bằng phương pháp điện di protein huyết thanh trên phiến acetacellulo và đo bằng khúc xạ kế.
3.3.2. Nghiên cứu mối quan hệ di truyền giữa vịt Cổ Lũng với một số giống vịt nội của Việt Nam vịt nội của Việt Nam
Nghiên cứu đánh giá sự sai khác di truyền của vịt Cổ Lũng với một số giống vịt nội bằng chỉ thị phân tử SSR (Simple Sequence Repeats - trình tự lặp lại đơn giản).
- Lấy mẫu:
Ba mươi tám mẫu máu vịt thuộc 3 giống vịt là vịt Cổ Lũng, vịt Bầu Bến và vịt Cỏ thu được từ vịt nuôi tại Trung tâm nghiên cứu Vịt Đại Xuyên. Trong đó vịt Cổ Lũng gồm 25 mẫu máu, vịt Bầu Bến gồm 6 mẫu máu và vịt Cỏ gồm 7 mẫu máu. Các mẫu máu được lấy tại cùng thời điểm trước khi cho ăn. Vịt có sức khỏe bình thường, khơng dị tật hoặc tổn thương. Mẫu máu thu được cho vào ống chun dụng có nắp kín chứa dung dịch chống đơng EDTA, sau đó lắc đều và bảo quản trong hộp lạnh. Mẫu sau khi lấy xong được mang ngay về và gửi tại phịng Cơng nghệ AND ứng dụng, viện Cơng nghệ sinh học - Viện Hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam để phân tích đặc điểm di truyền và mối quan hệ di
truyền giữa các giống vịt với nhau. - Phân tích
+ Tách chiết DNA.
DNA được tách chiết theo hướng dẫn của bộ kit TIANamp Genomic DNA Kit với các bước sau:
Lấy 15 µl máu cho vào ống 2 ml;
Bổ sung 185 µl dung dịch GA vào và vortex;
Bổ sung 20 µl proteinase K vào và ủ trong 560C trong 2h;
Sau đó, bổ sung 200 µl GB vào và vortex, ủ 700
C trong 30 phút; Thêm 200 µl Ethanol 100% vào, vortex trong 15 giây trong 1 phút; Chuyển dung dịch sang ống Spin column và ly tâm 1200 rpm; Bổ sung 500 µl GD lên cột và ly tâm 1200 rpm trong 1 phút;
Bổ sung 600 µl PW lên cột và ly tâm 1200 rpm và lặp lại bước này; Bổ sung 50 µl H2O và ly tâm thu DNA ở 1200 rpm trong 1 phút. + Đánh giá độ tinh sạch của mẫu
DNA sau khi tách chiết sẽ được đo nồng độ OD trên máy đo quang phổ Nano Drop. Dựa vào sự hấp thụ mạnh ánh sáng ở bước sóng 260 nm của các base purine và pyrimidine, sẽ đo được giá trị mật độ quang ở bước sóng 260 nm
(OD260nm - Optical Density 260 nm) của các mẫu và cho phép xác định nồng độ
DNA trong mẫu. Để kiểm tra độ sạch của dung dịch, dung dịch DNA ở bước
sóng 280 nm (OD280nm) sẽ được đo. Ở bước sóng 280 nm, các protein có mức hấp
thụ cao nhất, nhưng các protein cũng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 260 nm như các axit nucleic và do đó làm sai lệch giá trị thật của nồng độ axit nucleic. Một dung dịch axit nucleic được xem là sạch (không tạp nhiễm protein) khi tỉ số
OD260nm/ OD280nm nằm trong khoảng 1,8 - 2,0.
+ PCR nhân gen
PCR với các mồi SSR (Simple Sequence Repeats) được thực hiện theo phương pháp của Sambrook and Russell (1989) với tổng thể tích là 25l/mẫu gồm những thành phần được trình bày ở Bảng 3.1.
Bảng 3.1. Thành phần phản ứng SSR – PCR STT Thành phần Thể tích (l) STT Thành phần Thể tích (l) 1 dH20 13,8 2 Buffer 10x 2,5 3 dNTP (25mM) 2,5 4 Mg2+(2,5mM) 2 5 Mồi xuôi (10pM) 1 6 Mồi ngược (10pM) 1
7 Enzyme Taq polymerase (5 UI/l) 0,2
8 DNA tổng số (50ng/l) 2
Tổng 25
Trộn đều các thành phần của hỗn hợp rồi chuyển vào máy PCR sau đó chạy theo chương trình sau:
1. 94oC trong 3 phút; 5. Lặp lại 32 chu kỳ từ bước 2 đến bước 4;
2. 94oC trong 30 giây; 6. 72oC trong 10 phút;
3. Ta trong 30 giây; 7. Giữ nhiệt độ 4oC trong 30 phút.
4. 72oC trong 30 giây;
Các mồi được sử dụng trong đánh giá được thể hiện trên Bảng 3.2
Bảng 3.2. Tên, trình tự và kiểu lặp lại của các mồi sử dụng
Stt Tên mồi Trình tự Ta (0C) Kiểu lặp lại
1 CAUD035 GTGCCTAACCCTGATGGATG CTTATCAGATGGGGCTCGGA 63 (CA)n 2 CAUD025 AGTTCATCCCGATTTGTAGC AAATGCAGTGAGGTAAACCC 63 (CA)4A3(CA)10 3 CAUD027 AGAAGGCAGGCAAAATCAGAG TCCACTCATAAAAACACCCACA 66 (CA)11 4 CAUD026 TCCACTCATAAAAACACCCACA CTTTGCCTCTGGTGAGGTTC 60 (AC)17 5 CAUD031 AGCATCTGGACTTTTTCTGGA CACCCCAGGCTCTGAGATAA 51 (TTTC)9(TC)25
Stt Tên mồi Trình tự Ta (0C) Kiểu lặp lại 6 CAUD033 ACCCAGAAGAGTCAAGAATAG GAGTATTCCTGGTCTGTGCT 58 (AC)10…. T9 7 CAUD015 ACAACCCACTTCCAGAACTG GCATGTCAGAGATGCGTGC 68 (CA)3(CG)2(CA)25… A9 8 CAUD011 TGCTATCCACCCAATAAGTG CAAAGTTAGCTGGTATCTGC 50 (CA)13 9 CAUD012 ATTGCCTTTCAGTGGAGTTTC CGGCTCTAAACACATGAATG 63 (CA)2CG(CA)7 10 CAUD021 TGCAGGTTCCATGTGTTAGA TGACAACAAATGAGAAATGAGT 60 (CA)9 11 CAUD019 CTTAGCCCAGTGAAGCATG GCAGCATTTTACTTATGACTC 68 (TTTC)23 12 CAUD017 AGAAATACACTTACAGCACT TGTCATAAAATGGTTAATTGC 58 (TC)4(TTTC)2CTTC (TTTC)2 CTTC(TTTC)9(TC)20 Nguồn: Huang et al. (2005)
+ Điện di trên gel polyacrylamid
Chuẩn bị gel chạy điện di:
Gel điện di bao gồm 80ml polyacrylamide 6%, bổ sung thêm 80l TEMED, và 400l APS 10%. Bảng 3.3. Thành phần gel polyacrylamide 6% Tên Nồng độ gốc Nồng độ sử dụng Thể tích lấy Polyacrylamid 30% 6% 100ml Ure 420g/l 420g/l 210g TAE 50X 1X 10ml Dẫn H20 lên thể tích 500ml
Chuẩn bị dung dịch nhuộm:
Dung dịch cố định (1 lít), bao gồm 100ml CH3COOH, thêm nước cất cho
đủ một lít, dung dịch này dùng được 2 lần.
Dung dịch hiện (1 lít), bao gồm 30 gam sodium cacbonat, thêm vào 1,5ml
HCHO, 0,4ml Na2S2O3 và thêm nước cất cho đủ 1 lít. Đưa vào tủ lạnh, dung dịch
hiện chỉ dùng được một lần và chỉ phát huy tác dụng khi được giữ lạnh.
Dung dịch nhuộm (1 lít), bao gồm 1gam AgNO3, 1,5ml HCHO, thêm nước
cất vừa đủ 1 lít, dung dịch dùng được 2 lần.
Tiến hành nhuộm bản gel:
Gel sau khi được điện di ở công suất 30W trong 1 - 2 giờ, được đưa vào dung dịch cố định đặt lên máy lắc trong 30 phút cho đến khi khơng cịn thấy các vạch nhuộm màu.
Rửa bản gel 2 lần bằng nước cất, mỗi lần 3 phút.
Nhuộm gel bằng dung dịch nhuộm ít nhất trong 30 phút trên máy lắc.
Rửa bản gel đã nhuộm thật nhanh bằng nước cất, rửa trong không quá 10 giây.
Cho bản gel đã rửa vào dung dịch hiện đã được làm lạnh ở 10oC. Đặt lên
máy lắc từ 5 - 10 phút, cho đến khi thấy nổi rõ các băng điện di.
Cố định gel bằng dung dịch cố định trong 3 - 5 phút, kết thúc phản ứng nhuộm. Rửa lại bản gel bằng nước cất và để khơ ở nhiệt độ phịng.
+ Phân tích kết quả
Xử lý kết quả phân tích SSR theo Nei (1987).
Dựa vào ảnh điện di sản phẩm PCR và sự xuất hiện các băng SSR của các giống vịt đối với các mồi để làm cơ sở cho việc phân tích số liệu.
Phân tích số liệu theo quy ước: - Số 1 - xuất hiện băng SSR;
- Số 0 - không xuất hiện băng SSR.
Các số liệu này được nhập vào phần mềm Excel theo từng mồi.
Hệ số đa dạng di truyền H cho mỗi chỉ thị phân tử được tính theo cơng thức:
H = 1 - ∑ Pi2
Lập cây phân loại:
Số liệu được đưa vào phần mềm chuyên dụng NTSYS pc version 2.0 để tìm ra sự sai khác giữa các giống vịt thông qua biểu đồ cây ở hệ số tương đồng Jaccard. Phân tích và đánh giá hệ số tương quan kiểu hình theo phương pháp phân nhóm UPGMA.
Sau đó sử dụng phần mềm NTYSYS version 2.1 để lập biểu đồ phân nhóm 2 chiều dựa trên phân tích PCA (principal Coordinate analysis) qua đó sẽ lập thêm phân nhóm dựa trên khoảng cách di truyền giữa các giống vịt nghiên cứu.
3.3.3. Xác định khả năng sinh sản của vịt Cổ Lũng
Để đánh giá khả năng sinh sản của vịt Cổ Lũng, một thí nghiệm được thực hiện ở thế hệ thứ 3 gồm 540 con mới nở, chia thành 3 lơ, mỗi lơ gồm 180 con có tỷ lệ trống mái là 1/5 (36 trống và 144 mái). Vịt được đeo số cánh từ 1 ngày tuổi,
nuôi chung trong mỗi ơ chuồng có diện tích 25m2, nuôi 60 con/ô chuồng. Quy
trình chăm sóc, ni dưỡng, quy trình vệ sinh thú y, phịng bệnh theo quy trình của Trung tâm nghiên cứu Vịt Đại Xuyên. Chế độ dinh dưỡng và tiêu chuẩn cho ăn được thể hiện như Bảng 3.4 và Bảng 3.5.
Bảng 3.4. Thành phần dinh dƣỡng trong thức ăn sử dụng cho vịt Cổ Lũng theo các giai đoạn
Giai đoạn Protein tổng số (%) Năng lượng trao đổi (kcal/kg)
1nt - 8 tuần tuổi 20 - 21 2850 - 2900
9 - 22 tuần tuổi 13,5 - 14,5 2850 - 2900
Sinh sản 16,5 - 17,5 2650 - 2700
Giai đoạn vịt con: (0-8 tuần tuổi) chọn vịt giống loại 1, cho vịt ăn hạn chế theo định mức khẩu phần thức ăn, cứ 1 tuần cân khối lượng 1 lần, cân từng con và cân vào 1 giờ, 1 ngày cố định trước khi cho vịt ăn bằng cân điện tử có độ chính xác 0,05g.
+ Giai đoạn vịt hậu bị: 9 tuần tuổi đền khi vịt đẻ, cho ăn hạn chế theo định mức khẩu phần, cân khối lượng vịt 2 tuần/lần, cân bằng cân đồng hồ 5kg có độ chính xác ± 30g.
+ Giai đoạn vịt đẻ: được tính từ khi tỷ lệ đẻ của đàn đạt 5%, vịt được sử dụng cám đẻ 2 tuần trước khi vào đẻ, và ăn theo chế độ dựng đẻ.
Bảng 3.5. Tiêu chuẩn ăn của vịt Cổ Lũng (g/con/ngày)
Ngày tuổi g/con/ngày Ngày tuổi g/con/ngày Ngày tuổi g/con/ngày
1 4 12 48 23 92 2 8 13 52 24 96 3 12 14 56 25 100 4 16 15 60 26 104 5 20 16 64 27 108 6 24 17 68 28 - 56 112 7 28 18 72 57 - 98 135 8 32 19 76 99 - 112 140 9 36 20 80 113 - 126 150 10 40 21 84 127 - 140 160 11 44 22 88
- Số lượng vịt mái được chọn để đưa vào đẻ lúc 22 tuần tuổi là 240 con, vịt trống là 48 con, chia làm 3 lô với tỷ lệ trống mái là 1/5 (80 mái, 16 trống).
Các chỉ tiêu và phương pháp theo dõi như sau:
- Theo dõi tỷ lệ nuôi sống của đàn vịt con và vịt hậu bị.
Hàng ngày theo dõi số lượng vịt cịn sống, vịt chết, để tính tỷ lệ ni sống. + Tỷ lệ nuôi sống (%): là tỷ lệ phần trăm giữa số con còn sống đến cuối kỳ so với tổng số con đầu kỳ.
Tỷ lệ nuôi sống (%) = Số con còn sống đến cuối kỳ (con) x 100
Số con đầu kỳ (con) - Theo dõi khối lượng của vịt mái qua các giai đoạn
Hàng tuần cân khối lượng vịt vào lúc sáng sớm khi chưa cho ăn bằng cân điện tử, độ chính xác ± 0,05g để theo dõi khối lượng cơ thể vịt qua các giai đoạn.
- Đánh giá năng suất trứng và tiêu tốn thức ăn cho sản xuất trứng.
Hàng ngày thu trứng, đếm số lượng để tính tỷ lệ đẻ và năng suất trứng, cân tổng lượng thức ăn sử dụng để tính tiêu tốn thức ăn.
với tổng số mái bình qn có mặt trong kỳ (con).
Tỷ lệ đẻ (%) = Số trứng đẻ ra trong kỳ (quả)
x 100 Số mái đẻ bình qn có mặt kỳ (con)
+ Năng suất trứng (quả/mái): là số trứng của một vịt mái đẻ ra trong khoảng thời gian nhất định.
+ Năng suất trứng (quả/mái/kỳ) = Số trứng đẻ ra trong kỳ (quả)
Số mái đẻ bình qn có mặt trong kỳ (con) + Năng suất trứng tích lũy
hàng tuần (quả/mái) = tuần trước (quả/mái) Năng suất trứng + tuần kế tiếp (quả/mái) Năng suất trứng của
- Đánh giá các chỉ tiêu chất lượng trứng
Chất lượng trứng vịt được khảo sát ở tuần tuổi thứ 38. Ba mươi quả trứng có khối lượng và hình dạng trung bình của trứng được chọn để đánh giá các chỉ tiêu chất lượng trứng. Các chỉ tiêu khảo sát bao gồm: cân khối lượng trứng (g), khối lượng lòng đỏ (g), khối lượng lịng trắng (g), khối lượng vỏ (g), đường kính lớn (mm), đường kính nhỏ (mm), đường kính lịng đỏ (mm), chiều cao lịng đỏ (mm), chiều cao lòng trắng đặc (mm), đường kính lịng trắng đặc (mm); độ dày vỏ ở đầu to, đầu nhỏ và xích đạo (mm), đơn vị Haugh. Trên cơ sở các chỉ tiêu