CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2 Phương pháp nghiên cứ u
2.2.1 Đánh giá khả năng sử dụng chủng Saccharomyces boulardii trong
sản xuất bia
2.2.1.1. Phân lập và khảo sát các đặc điểm của chủng Saccharomyces
boulardii từ chế phẩm Bioflora
Chế phẩm Bioflora 100mg của Laboratoires Biocodex, Pháp được sử dụng để phân lập chủng nấm men probiotic Saccharomyces boulardii. Một trăm miligam chế phẩm được hoà tan trong nước cất vơ trùng, sau đó được cấy vạch trên đĩa petri
chứa thạch YPD (cao nấm men 1%, pepton 2%, glucose 2%, agar 1%) để thu nhận các khuẩn lạc đơn.
Để chứng tỏ khuẩn lạc thu được là Saccharomyces cerevisiar var. boulardii, khuẩn lạc được nuôi cấy thu sinh khối và đem giải trình tự ITS (mồi ITS1 và ITS4),
đồng thời khuẩn lạc chủng được đánh giá khảnăng sử dụng đường galactose. Giải trình tự ITS
– Một khuẩn lạc đơn của chủng được hoà tan trong ống eppendorf có chứa 100µL dung dịch ly giải tế bào, 100µL dung dịch ly giải màng nhân và 0,5g bi thuỷ tinh (glass beads), vortex hỗn hợp trong khoảng 5 phút.
– Chuyển 200µL dịch nổi sang ống eppendorf mới có chứa sẵn 100µL dung dịch kết tủa protein, trộn đều, ủ trong đá 5 phút, sau đó ly tâm 12.000
vòng/phút trong 5 phút để thu dịch nổi.
– Chuyển 100µL dịch nổi vào ống eppendorf có chứa 200µL isopropanol,
đảo trộn nhẹnhàng cho đến khi thấy kết tủa trắng xuất hiện. Ly tâm hỗn hợp với tốc độ 12.000 vịng/phút tong 10 phút và rửa bằng 100µL ethanol 70%.
– DNA thu được bằng cách ly tâm ở tốc độ 12.000 vòng/phút trong 5 phút
để loại bỏ ethanol, sau đó được hồ tan trong 100 µL đệm TE, ủ ở 60oC trong 2 giờ. Ly tâm loại cặn và thu dịch DNA.
– Nồng độ DNA sau khi tách chiết được xác định trên máy Nanodrop.
– DNA sẽ được PCR khuếch đại trình tự vùng D1/D2 với mồi NL1 (5’
GCA TAT CAA TAA GCG GAG AAG 3’), NL4 (5’ GGT CCG TGT TTC AAG
ACG G 3’) và vùng trình tự ITS với mồi ITS1 (5’ TCC GTA GGT GAA CCT
GCG G 3’) và ITS4 (5’ TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC 3). Chu trình nhiệt:
28 55oC trong 45 giây,giai đoạn kéo dài 72oC trong 1 phút 30 giây lặp lại 35 chu kỳ,
kéo dài giai đoạn cuối 72oC trong 6 phút. Thành phần của phản ứng PCR liệt kê trong Bảng 2.1. Bảng 2.1: Thành phần phản ứng PCR – Giải trình tự Thành phần Thể tích (µL) Mix 2X (Promega) 15 Mồi xuôi 2 Mồi ngược 2 DNA khuôn 1,2 Nước 5,3
– Các sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1% trong đệm TAE 1X,
cường độ 50V, thời gian 1 giờ.
– Sản phẩm PCR được gửi giải trình tự tại Cơng ty TNHH Phát triển Công
nghệỨng dụng Việt Nam VNDAT.
– Trình tự gen thu được sau khi giải trình tự được xử lý bằng phần mềm FinchTV để phân tích các peak nucleotide. Mỗi peak tương ứng với một nucleotide nhất định A, T, G, C. Các peak khơng bị chồng chéo lên nhau thì kết quả giải trình tựđáng tin cậy. Đoạn đầu và đoạn cuối của gen được cắt bỏ khoảng 20 nucleotide vì kết quả giải trình tựhai đầu thường khơng đáng tin cậy.
– Sau khi xử lý, trình tựđược đưa vào phần mềm BLAST để so sánh trình tự ITS với các chủng trên ngân hàng gen.
Đánh giá khả năng sử dụng đường galactose
Saccharomyces cerevisiae var. boulardii được các nghiên cứu chỉ ra khả
năng sử dụng đường galactose kém hơn so với các Saccharomyces cerevisiae
thông thường, nên để khẳng định khuẩn lạc tách từ chế phẩm là S.boulardii, trong thí nghiệm này, khả năng sử dụng đường galactose của khuẩn lạc thu nhận được
so sánh với Saccharomyces cerevisiae SafAle US-05 (Fermentis, Lesaffre, Pháp).
Đồng thời, khảnăng sử dụng đường glucose của 2 khuẩn lạc này cũng được đánh
giá.
– Các khuẩn lạc được hoạt hố trong mơi trường YPD lỏng ở 25oC, lắc 120 vòng/phút trong 24 giờ.
29 – Từ dịch hoạt hố, mỗi loại nấm men được ni tiếp trong 100mL hai loại
môi trường lỏng là: YPD-glucose (cao nấm men 1%, pepton 2%, D-glucose 2%) và YPD-galactose (cao nấm men 1%, pepton 2%, D-galactose 2%) ở 25oC, lắc 120 vòng/phút với lượng nấm men cấp vào là như nhau 106 tế bào/mL.
– Tiến hành lấy mẫu theo thời gian để theo dõi sựthay đổi của mật độ tế bào nấm men và hàm lượng đường trong môi trường trong 24 giờ. Mật độ tếbào được
xác định bằng phương pháp đếm trực tiếp số lượng tế bào. Hàm lượng đường
glucose và galactose trong môi trường được xác định bằng phương pháp Sắc ký lỏng hiệu năng cao.
– Từ số liệu thu được, so sánh khả năng sinh trưởng và sử dụng đường glucose và galactose của hai chủng.
Sau khi có được khuẩn lạc của chủng, tiến hành các thí nghiệm khảo sát đặc
điểm của chủng và đánh giá khảnăng sử dụng chủng này trong sản xuất bia.
Để có được những thông tin cơ bản về chủng, tiền hành các thí nghiệm để
khảo sát đặc điểm hình thái của khuẩn lạc, tế bào và xây dựng đường cong sinh
trưởng của chủng S.boulardii đã được phân lập. Các thí nghiệm này đều được thực hiện trên môi trường YPD. Khuẩn lạc nấm men được nuôi trong 50mL môi trường YPD lỏng ở 25oC, lắc 120 vòng/phút trong 24 giờ. Từ dịch hoạt hố này, nấm men
được ni tiếp trong 100mL môi trường YPD lỏng ở cùng điều kiện để tiến hành quan sát hình thái tế bào và theo dõi mật độ tế bào theo thời gian, xây dựng đường
cong sinh trưởng.
Xây dựng đường cong sinh trưởng
– Sau khi hoạt hoá, nấm men được nuôi trong 100mL dịch môi trường YPD
ở 25oC, lắc 120 vòng/phút với mật độban đầu là 106 tế bào/mL.
– Lấy mẫu theo thời gian để theo dõi mật độ tế bào nấm men, xác định bằng phương pháp đếm trực tiếp số lượng tế bào, để lập được đường cong sinh
trưởng của chủng đến khi chủng đã vào pha suy vong.
2.2.1.2. Ảnh hưởng của độ cồn và độ đắng tới sự phát triển của chủng
Sau khi có những thông tin cơ bản về chủng, tiến hành đánh giá khảnăng sử
dụng chủng trong sản xuất bia. Dịch lên men bia có hai đặc trưng khác với các mơi
trường thơng thường để nấm men phát triển: có cồn và có các thành phần tạo vị đắng (iso α-axit đắng từ hoa houblon).
30 Chủng sẽđược nuôi trong môi trường YPD lỏng và có bổ sung thêm ethanol tinh khiết vào dịch sao cho đạt các nồng độ cồn khác nhau: 0%, 2,5%, 5%, 7,5% và 10% (v/v). Các mẫu thí nghiệm được bổ sung lúc ban đầu với lượng nấm men
đã được hoạt hố như nhau (6×106 tếbào/mL) trong 100mL mơi trường, ni ở
25oC, lắc 120 vịng/phút. Tiến hành theo dõi mật độ tế bào nấm men trong các mẫu theo thời gian.
Dịch chiết iso α-axit đắng có độđắng 200 IBU được bổ sung vào mơi trường
YPD lỏng để tạo các độđắng khác nhau: 0 IBU, 10 IBU, 15 IBU, 20 IBU và 25
IBU. Các mẫu thí nghiệm được bổ sung lúc ban đầu với lượng nấm men đã được hoạt hoá như nhau (6×106 tế bào/mL) trong 100mL mơi trường, ni ở 25oC, lắc 120 vòng/phút. Tiến hành theo dõi mật độ tế bào nấm men trong các mẫu theo thời gian.
2.2.2 Nghiên cứuchế độ đường hoá và kỹ thuật lên men tạo bia nồng độ cồn thấp và lượng sinh khối cao bằng chủng Saccharomyces boulardii
Nghiên cứu các phương pháp sinh học trong sản xuất bia không cồn và bia có nồng độ cồn thấp: chế độđường hố và các kỹ thuật lên men.
Hoạt hoá và nhân giống nấm men
Mơi trường hoạt hố và nhân men sử dụng trong các thí nghiệm ở nội dung này là dịch chiết malt thu nhận từ malt Pilsner (Weyermann, Đức). Malt được nghiền và phối trộn với nước 65oC theo tỷ lệ malt : nước là 1 : 5, giữ ở nhiệt độ này trong vòng 1 giờ. Hỗn hợp được nâng nhiệt lên 76oC rồi lọc thu dịch trong và bổ sung nước để nồng độ chất hoà tan trong dịch là 10oP. Trước khi sử dụng, dịch chiết này được tiệt trùng ở 110oC trong 30 phút.
Để hoạt hoá, khuẩn lạc nấm men được nuôi trong 50mL môi trường này ở
25oC, lắc 120 vịng/phút trong 24 giờ.
Từ dịch hoạt hố này, nấm men được tiếp tục nhân giống trong thể tích 200mL trong điều kiện tương tự nhưng với thời gian 10-12 giờ.
Chọn nguyên liệu malt
Hai loại malt được lựa chọn sử dụng trong sản xuất là Pilsner và Carabelge (Weyermann). Nguyên liệu malt được phân tích một số chỉ tiêu cơ bản: độẩm, độ hoà tan và độ màu. Căn cứ vào các chỉ tiêu để đưa ra tỷ lệ phối malt thích hợp (dựa vào độ màu mong muốn của sản phẩm và khuyến cáo của nhà sản xuất).
31
2.2.2.1. Nghiên cứu các chế độ đường hố
Để tạo ra bia có nồng độ cồn thấp, tỷ lệ đường lên men được trong dịch đường lên men cần phải thấp. Trong nội dung này, kỹ thuật đường hoá ở nhiệt độ cao đã được nghiên cứu với mong muốn thu được dịch đường có tỷ lệ đường lên men được thấp. Hai loại malt theo tỷ lệ phối đã chọn sẽ được nghiền và phối trộn với nước theo tỷ lệ malt : nước là 1 : 5 để tiến hành đường hoá theo các chế độ
khác nhau, sau đó lọc hỗn hợp để thu được dịch trong.
Tiến hành khảo sát với 4 chế độ đường hoá:
– Chế độ 1: giữ tại 72oC trong 60 phút. – Chế độ 2: giữ tại 72oC trong 45 phút. – Chế độ 3: giữ tại 72oC trong 30 phút. – Chế độ 4: giữ tại 78oC trong 30 phút.
Đánh giá các chỉ tiêu của dịch đường thu được ở mỗi chế độ: nồng độ chất
hoà tan bằng phương pháp cân tỷ trọng vàhàm lượng nito amin tự do – FAN. Hàm
lượng hai loại đường lên men chính trong dịch đường là maltose và glucose được xác định bằng phương phápSắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC.
Dịch đường được tiệt trùng ở 110oC trong 30 phút. Cấp men giống đã được
nhân men vào 100mL dịch chiết sau khi tiệt trùng với mật độ 107tế bào/mL, nuôi
ở 25oC, lắc 120 vòng/phút.
Theo dõi mật độ nấm men trong dịch lên men đến khi thấy mật độ tế bào nấm men khơng tăng lên (sau 3 ngày) thì coi như quá trình lên men đã kết thúc.
Kết thúc quá trình lên men, xác định nồng độ các chất hồ tan cịn lại trong dịch và nồng độ cồn tạo ra. Lượng đường mà nấm men có thể sử dụng được chính là lượng chất hồ tangiảm đi sau q trình lên men. Từ đó, xác định được tỷ lệ đường lên men được chính bằng tỷ lệ giữa lượng đường nấm men đã sử dụng trên tổng lượng chất hoà tan ban đầu.
2.2.2.2. Nghiên cứu kỹ thuật lên men
Hầu hết nấm men có hiệu ứng Crabtree, khi nồng độ đường lên men trong dịch lớn thì nấm men sẽ chủ yếu lựa chọn con đường lên men tạo cồn ngay cả khi được cấp đủ oxy [65]. Để giảm lượng cồn tạo thành trong quá trình lên men, trong thí nghiệm này, các kỹ thuật lên men cấp dưỡng được sử dụng nhằm duy trì hàm lượng đường lên men được trong mơi trường thấp, qua đó góp phần giảm lượng
32
cồn tạo thành và tăng sinh khối của nấm men. Các thí nghiệm sử dụng dịch đường thu được từ chế độ đường hoá đã chọn từ thí nghiệm trước để tiến hành. Hỗn hợp
malt sau khi nghiền sẽ được phối trộn với nướctheo tỷ lệ malt : nước là 1 : 5 và tiến hành đường hoá ở chế độ đã chọn, lọc và rửa bã đến khi thu được dịch đường có nồng độ chất hồ tan là 5-6oP. Sau đó, 7L dịch đường được đun sơi với 10g hoa
Saaz có hàm lượng α-axit đắng là 3,5% trong 60 phút đểđược dịch cóđộ đắng là
15-20 IBU. Kết thúc sơi, điều chỉnh nồng độ chất hoà tan trong dịch đường về
5,5oP bằng nước vô trùng. Làm nguội dịch về 25oC, đưa vào các bình lên men đã được vơ trùng để tiến hành các thí nghiệm lên men tại nhiệt độ này.
Hai kỹ thuật lên men được áp dụng trong nghiên cứu:lên men theo mẻ không cấp dưỡng (batch fermentation) và lên men cấp dưỡng (fed-batch fermentation).
Lên men theo mẻ khơng cấp dưỡng
Thí nghiệm lên men theo mẻ khơng cấp dưỡngđược thực hiện trong thể tích 5L. Toàn bộ dịch đường lên men được sử dụng ngay từ đầu, mật độ nấm men cấp vào ban đầu là 107tế bào/mL, tiến hành lên men ở 25oC và khơng sục khí vơ trùng
trong q trình lên men. Lấy mẫu trong quá trình lên men định kỳ theo thời gian
tới 24 giờ để đo các chỉ tiêu: pH, mật độ tế bào nấm men và phân tích các thành
phần đường chính trong dịch (maltose và glucose) và cồn tạo ra trong dịch lên men. Thí nghiệp được tiến hành 2 lần.
Lên men cấp dưỡng
Các thí nghiệm được thực hiện ở 25oC, mật độ nấm men cấp vào đầu quá
trình là 107 tế bào/mL. Tổng thể tích dịch lên men của các thí nghiệm đều là 5L
với lượng dịch ban đầu là 1,5L. Tại thời điểm sau khi tế bào vào pha cân bằng, lúc hàm lượng đường lên men chính (bao gồmmaltose và glucose) cịn lại khơng đáng kể (10 giờ - theo dữ liệu củamẻ không cấp dưỡng), phần dịch đường còn lại (3,5L) bắt đầu được bổ sung vào với các tốc độ khác nhau: 1L/giờ, 0,5L/giờ và 0,25L/giờ bằng bơm nhu động. Khơng khí vơ trùng được cấp vào dịch lên men với tốc độ 0,5L/phút trong 5 phút, sau đó nghỉ 5 phút trước khi sục khí trở lại, trong tồn bộ q trình cấp dưỡng. Trong q trình làm các thí nghiệm lên men, tiến hành lấy mẫu định kỳ tới 24-30 giờ (tuỳ thuộc tốc độ cấp dưỡng) để đo các chỉ tiêu: pH,
mật độ tế bào nấm men và phân tích thành phần đường chính (gồm maltose và
33
2.2.3 Tiến hành sản xuất ở quy mơ phịng thí nghiệm (20L). Đánh giá chất lượng của sản phẩm chất lượng của sản phẩm
Hoạt hoá và nhân giống nấm men
Dịch chiết malt thu nhận từ malt Pilsner (Weyermann, Đức) được sử dụng làm mơi trường để hoạt hố và nhân men trong sản xuất bia quy mô 20L. Malt được nghiền và phối trộn với nước 65oC theo tỷ lệ malt : nước là 1 : 5, giữ ở nhiệt độ này trong vòng 1 giờ. Hỗn hợp được nâng nhiệt lên 76oC rồi lọc thu dịch trong và bổ sung nước để nồng độ chất hoà tan trong dịch là 10oP. Trước khi sử dụng, dịch chiết này được tiệt trùng ở 110oC trong 30 phút.
Để hoạt hoá, khuẩn lạc nấm men được nuôi trong 100mL môi trường này ở
25oC, lắc 120 vòng/phút trong 24 giờ.
Từ dịch hoạt hoá này, nấm men được tiếp tục nhân giống trong thể tích 1000mL trong điều kiện tương tự nhưng với thời gian 10-12 giờ.
Sản xuất bia quy mô 20L
Hai loại malt sử dụng trong sản xuất là Pilsner và Carabelge (Weyermann)
được phối theo tỷ lệ: 70% Pilsner và 30% Carabelge, được nghiền bằng máy nghiền một cặp trụckích thước khe trục 0,75mmtrước khi tiến hành sản xuất dịch đường lên men.
Để sản xuất dịch đường lên men, 3kg hỗn hợp 2 loại malt đã nghiền được phối với 15L nước (tỷ lệ malt : nước là 1 : 5) và tiến hành đường hoá theo chế độ đường hoá và phương án lên men đã chọn. Kết thúc q trình đường hố, lọc để thu được dịch đường và rửa bã bằng nước 78oC đến khi thu được dịch đường có nồng độ chất hồ tan là 5-6oP (khoảng 25L dịch). Đun sôi dịch đường sau khi lọc với 35g hoa Saaz 3,5% α-axit đắng (bổ sung khi dịch bắt đầu sôi) trong 60 phút, bổ sung thêm nước trong q trình sơi để duy trì nồng độ chất hồ tan trong dịch
là 5-6oP. Sau khi kết thúc đun sôi, để lắng và làm nguội dịch về 25oC. Lọc thu dịch trong, kiểm tra nồng độ chất hoà tan của dịch và bổ sung thêm nước vô trùng để đảm bảo nồng độ chất hoà tan là 5-6oP trước khi lên men. Tiến hành lên men 20L dịch trong thiết bị lên men vô trùng. Bổ sung nấm men Saccharomyces boulardii
đã được hoạt hoá và nhân giống vào dịch đường lên men với mật độ 107tế bào/mL. Trong quá trình lên men chính, lấy mẫu bia theo ngày để theo dõi các chỉ tiêu: pH và mật độ nấm men, từ đó xác định được thời điểm kết thúc q trình lên men chính, chuẩn bị tiến hành đóng chai và ủ chín bia trong chai.