STT Chỉ tiêu Đơn vị Pilsner Carabelge
1 Độẩm % 6,31 6,23
2 Độ hoà tan % 78,61 71,43
3 Độ màu EBC 5,47 36,05
Hình 3.8: Dịch chiết thu được từ hai loại malt
(1 – Malt Pilsner; 2 – Malt Carabelge)
Với mong muốn tạo ra dịch đường có màu vàng đậm như màu mật ong,
nghiên cứu đã kết hợp cả hai loại malt để sử dụng trong sản xuất dịch đường của toàn bộ nghiên cứu. Để đảm bảo chất lượng của dịch đường vẫn đạt những tiêu chuẩn cơ bản để lên men, tỷ lệ sử dụng malt Carabelge được khuyến cáo sử dụng là 30%. Vì thế, tỷ lệ hai loại malt được lựa chọn sử dụng trong toàn bộ nghiên cứu là 70% malt Pilsner và 30% malt Carabelge.
3.2.1 Nghiên cứu kỹ thuật đường hoá
Căn cứ vào tác động của nhiệt độ tới các enzym thuỷ phân tinh bột thành
đường trong malt để lựa chọn ra chếđộđường hoá phù hợp, tạo ra được dịch đường có tỷ lệđường lên men được như mong muốn. Phổ các loại đường trong dịch lên men phụ thuộc vào hoạt động của các enzym trong malt, thuỷ phân tinh bột thành
54
đường trong q trình đường hố. ꞵ-amylase tạo ra đường có thể lên men được (chủ yếu là maltose) có nhiệt độ tối ưu là 62-65oC, trong khi đó, α-amylase tạo ra
đường khơng lên men (chủ yếu là dextrin) có nhiệt độ tối ưu là 72-75oC [7]. Chính vì thế, việc điều chỉnh nhiệt độ và thời gian giữ nhiệt trong quá trình đường hố là
cách điều chỉnh phổđường trong dịch lên men, từđó điều chỉnh được nồng độ cồn trong sản phẩm.
Với mong muốn tạo ra dịch đường lên men có hàm lượng đường lên men
được thấp, bốn chếđộđường hoá ở nhiệt độcao sau đã được khảo sát: – Chếđộ 1: giữ tại 72oC trong 60 phút. – Chếđộ 2: giữ tại 72oC trong 45 phút. – Chếđộ 3: giữ tại 72oC trong 30 phút. – Chếđộ 4: giữ tại 78oC trong 30 phút. Bảng 3.2: So sánh các chế độ đường hoá STT Các chỉ tiêu Đơn vị 72 oC/60 phút 72oC/45 phút 72oC/30 phút 78oC/30 phút 1 Hàm lượng maltose + glucose g/100mL 7,67 7,40 6,20 4,26
2 Độ hoà tan ban đầu g/100mL 15,06 14,87 14,46 13,94
3 Độ hoà tan cuối g/100mL 7,40 7,43 8,26 9,30
4 Lượng đường đã lên men g/100mL 7,90 7,48 6,26 4,64
5 Tỷ lệđường đã lên men % 52,46 50,30 43,29 33,29
6 Nồng độ cồn % v/v 3,54 3,31 3,25 2,58
7 Hàm lượng FAN mg/L 190,21 183,47 176,00 165,35
Nhiệt độđường hố là yếu tố có tác động lớn tới hàm lượng các loại đường
được tạo ra trong q trình này, do nhiệt độ cao làm hoạt tính của enzym bị suy giảm nhanh [80]. Theo kết quả nghiên cứu của Evans và cộng sự, với nhiệt độ trên 75oC, lượng đường maltose được tạo ra ít, chiếm khoảng 50% (thấp hơn so với
68% khi đường hoá ở 65oC), đồng thời, các thành phần không lên men được tăng
[81]. Kết quả của khảo sát (Bảng 3.2) cũng cho thấy kết quảtương tự. Khi đường hoá ở nhiệt độ 72oC, lượng đường có thểlên men được (chênh lệch giữa độ hoà
55
tan ban đầu của dịch trước lên men và độ hoà tan cuối sau khi lên men, chủ yếu là
đường maltose và glucose) chiếm khoảng 43,29-52,46% lượng chất hoà tan trong dịch, và giảm xuống cịn 33,29% khi đường hố ở nhiệt độcao hơn là 78oC. Đây
là tỷ lệđường lên men được phù hợp với mục tiêu của nghiên cứu. Tuy nhiên, hàm
lượng nito amin tự do trong dịch thu được từ chếđộ đường hoá ở 78oC thấp hơn
so với các chếđộ còn lại (165,35mg/L). Đây là nguồn dinh dưỡng cho nấm men
phát triển. Thông thường, hàm lượng FAN trong dịch đường trong khoảng 100-
120mg/L là cần thiết để nấm men phát triển (phụ thuộc vào nồng độ chất hoà tan trong dịch) [74]. Vì thế, chất lượng dịch đường thu được từ chếđộ đường hố này
hồn tồn đáp ứng yêu cầu để lên men, nên nghiên cứu lựa chọn chếđộđường hoá 78oC trong 30 phút để sản xuất dịch đường lên men tạo sản phẩm bia có nồng độ
cồn thấp.
Theo kết quả của khảo sát (Bảng 3.2), dịch đường thu được từ chếđộ đường hoá 78oC trong 30 phút có nồng độ hồ tan là 13,94g/100mL (tương ứng với 13,25oP), tỷ lệđường lên men được là 33,29%, sau khi lên men sẽthu được dịch có nồng độ cồn là 2,58% v/v. Đểđạt được mục tiêu đề tài là tạo ra sản phẩm bia có nồng độ cồn thấp, khơng q 2% v/v, nồng độ chất hoà tan ban đầu của dịch lên men cần phải thấp. Tuy nhiên, nồng độ chất hồ tan trong dịch đường lên men khơng nên quá thấp, do lượng đường không thể lên men trong dịch đường có ảnh
hưởng đến hậu vị của sản phẩm. Thơng thường, hàm lượng chất hồ tan trong bia sẽ khoảng 3-4oP để hậu vị của sản phẩm không bị nhạt và người tiêu dùng không bị cảm giác “sốc” cồn khi uống. Với tỷ lệđường lên men được là 33,29% thì nồng
độ chất hồ tan ban đầu xác định khoảng 5-6oP, khi đó, hàm lượng chất hoà tan trong bia dự kiến khoảng 4oP, đảm bảo hậu vị cho sản phẩm. Muốn thu được nồng
độ chất hoà tan như vậy, tỷ lệmalt : nước phối trộn trước khi đường hoá là 1 : 5 và sau khi đường hoá, tiến hành lọc, rửa bã đến khi thu được dịch đường có nồng
độ chất hồ tan như mong muốn.
3.2.2 Nghiên cứu kỹ thuật lên men
Các phương án lên men: lên men theo mẻ không cấp dưỡng (batch fermentation) và lên men cấp dưỡng (fed-batch fermentation) được khảo sát trên dịch đường thu được từ chế độ đường hoá 78oC, 30 phút, lọc và rửa bã đến khi nồng độ chất hoà tan khoảng 5-6oP và được đun sơi với hoa houblon trong 1 giờ. Vì sản phẩm không đặt ra yêu cầu vềhương thơm đặc trưng nên hoa houblon được lựa chọn là hoa viên Saaz (Czech). Đây là loại hoa viên được sử dụng phổ biến trong sản xuất các loại bia nhẹnhư Pilsner và các loại bia Lager nói chung. Mục
56
đích của nghiên cứu này là muốn tìm ra phương án lên men để giảm lượng cồn tạo
thành và tăng lượng sinh khối nấm men sinh ra trong quá trình lên men. Tuy nhiên, phải kết hợp với cả chất lượng cảm quan của sản phẩm thu được để chọn phương
án lên men tạo sản phẩm cuối cùng.
3.2.2.1. Lên men theo mẻ không cấp dưỡng
Chủng Saccharomyces boulardii được lên men theo mẻ không cấp dưỡng và lấy mẫu theo dõi trong 24 giờ. Sự chuyển hoá đường maltose, glucose, sinh khối nấm men và cồn trong quá trình lên men này được thể hiện trên Hình 3.9. Có thể
thấy, đường maltose và glucose là các đường chính trong dịch đường, dễ sử dụng nên giảm nhanh từ 15,53g/L xuống dưới 0,61g/L tại thời điểm 10 giờ. Cùng với sự giảm đường, mật độ nấm men tăng từ 107 tế bào/mL lên 8,85×107 tế bào/mL tại 8 giờ và bước vào pha cân bằng.
Mật độ tếbào sau đó được duy trì trong khoảng 8,5 - 9,1×107 tếbào/mL đến hết 24 giờ theo dõi (Hình 3.9A). Trong điều kiện lên men theo mẻ không cấp
dưỡng, nấm men tạo cồn, thu năng lượng và hình thành sinh khối, nên cồn được tạo ra cùng sự phát triển của nấm men nhưng chậm hơn và kết thúc tăng tại thời
điểm 10 giờ, đạt (8,07g/L). Với tổng 5L dịch lên men, lượng tế bào tạo ra đạt cao nhất là 44×1010 - 45×1010 tếbào, tương ứng với tổng lượng cồn tạo ra đạt 40,35 g (Hình 3.9B).
3.2.2.2. Lên men cấp dưỡng
Việc sử dụng nồng độđường lên men cao thường ức chế sựsinh trưởng và phát triển của nấm men, ngồi ra có thể gây hiệu ứng Crabtree, hướng tế bào theo
con đường lên men thay vì hơ hấp ngay cả khi có mặt oxy, gây tăng hàm lượng cồn và giảm lượng sinh khối [65]. Trong phương án lên men cấp dưỡng, sau 10 giờ đầu lên men với lượng thể tích ban đầu 1,5L, tổng lượng đường maltose và glucose còn lại thấp (< 1g/L) thì bắt đầu bổ sung dịch đường vào với các tốc độ
khác nhau: 1L/giờ, 0,5L/giờ và 0,25L/giờ, có kèm theo sục khơng khí vơ trùng như đã mơ tả ở phần Phương pháp nghiên cứu. Quá trình cấp dưỡng diễn ra khi hết
lượng dịch 3,5L còn lại cho đến khi đạt tổng lượng dịch 5L. Sự biến đổi các chỉ
tiêu của quá trình lên men được thể hiện trên các hình: Hình 3.10, Hình 3.11 và
57
Hình 3.9: Sự thay đổi của các thơng số trong 24 giờ lên men theo mẻ không
cấp dưỡng
Trong cả ba thí nghiệm với các tốc độ cấp dưỡng sủ dụng, 10 giờ trước khi bắt đầu cấp dưỡng, quá trình lên men diễn ra tương tự nhau. Đường maltose và glucose giảm nhanh từ ban đầu về dưới 1g/L, mật độ tế bào nấm men tăng lên
khoảng 9,0 - 10×107 tế bào/mL (Hình 3.10, Hình 3.11 và Hình 3.12). Tương ứng
hàm lượng cồn tạo ra trong khoảng 6g/L (tại thời điểm 10 giờ). Sau thời điểm này, khi dịch đường được cấp vào dịch lên men với các tốc độ khác nhau thì sự vận
58
Hình 3.10: Sự thay đổi của các thơng số trong 24 giờ lên men cấp dưỡng
tốc độ 1 L/giờ
Đối với tốc độ 1L/giờ, chỉ mất khoảng 3,5 giờđể cấp hết lượng dịch còn lại,
lượng đường cấp thêm vào cho nấm men khá nhanh so với khảnăng tiêu thụ của
chúng nên lượng đường maltose + glucose tăng lên 9g/L, tại thời điểm 13 giờ (Hình 3.10A). Nấm men tiếp tục sử dụng đường này để tạo sinh khối và cồn. Nồng độ
cồn sau khi tiếp dịch vào giảm đi do pha lỗng và sau đó tăng trở lại khi nấm men tạo ra cồn từđường bổsung thêm, đạt nồng độ6,5g/L. Trong khi đó, mật độ tế bào chỉ có sự giảm nhẹ và tiếp tục được duy trì trong khoảng 9-10,5×107 tế bào/mL
59 (Hình 3.10A). Tính trên thể tích của dịch lên men, tổng lượng tếbào tăng dần và
đạt 48-52×1010 tế bào. Tổng lượng cồn tạo ra đạt 32-33g (Hình 3.10B).
Hình 3.11: Sự thay đổi của các thông số trong 24 giờ lên men cấp dưỡng tốc độ 0,5 L/giờ
60 Kết quả khảo sát các phương án lên men cho thấy phương án lên men
cấp dưỡng kèm sục khí có tác dụng làm tăng sinh khối nấm men nhưng lượng cồn giảm không đáng kể so với phương án lên men theo mẻ không cấp dưỡng.
Hơn nữa, lượng sinh khối quá nhiều cũng làm giảm tính chất cảm quan của sản phẩm. Vì thế, phương án lên men theo mẻ không cấp dưỡng được lựa chọn để
sử dụng trong sản xuất bia nồng độ cồn thấp của đềtài này. Phương án lên men
này cũng dễdàng hơn cho việc sản xuất bia ở quy mơ lớn.
Hình 3.12: Sự thay đổi của các thông số trong 24 giờ lên men cấp dưỡng tốc độ 0,25 L/giờ
61 Với tốc độ cấp dưỡng 0,5g/L (Hình 3.11), lượng đường được bổ sung thêm vào dịch chậm hơn, nên nồng độđường maltose + glucose chỉtăng lên 4g/L sau đó giảm dần (Hình 3.11A). Mật độ tế bào giảm nhẹ từ 9×107 tế bào/mL xuống khoảng 8×107 tếbào/mL, sau đó lại tăng nhanh và đạt 15×107 tế bào/mL (tại 17 giờ lên men). Cùng với đó, hàm lượng cồn cũng giảm nhẹ về 6g/L tại 15 giờ và
sau đó tăng nhẹ lên 6,2g/L từ 17 giờ trởđi. Tổng lượng tế bào tạo ra với tốc độ
cấp dịch 0,5L/giờ đạt 75-76×1010 tếbào, cao hơn so với tốc độ cấp dịch 1L/giờ
và lên men theo mẻ không cấp dưỡng. Tổng lượng cồn tạo ra là 31g, giảm nhẹ nhưng không đáng kể so với tốc độ 1L/giờ (Hình 3.11B).
Ở tốc độ cấp dịch thấp nhất trong nghiên cứu này là 0,25L/giờ, thời gian cấp dịch kết thúc 24 giờ. Với tốc độ cấp dịch thấp, lượng đường được đưa vào
chậm, kết hợp với việc nấm men sử dụng nên nồng độđường maltose + glucose trong dịch gần như được duy trì ở mức quanh giá trị < 1g/L, kết hợp với việc sục khí làm mật độ tế bào nấm men tăng lên mạnh mẽ, đạt 25,5×107 tế bào/mL tại 20 giờ (Hình 3.12A). Cùng với đó, nồng độ cồn có xu hướng giảm nhẹ về cuối q trình lên men (Hình 3.12A). Tính trên tổng thể tích dịch lên men, lượng tế
bào nấm men tạo ra trong trường hợp này đạt 117×1010 tế bào (Hình 3.12B), gấp 2,6 lần so với lên men theo mẻ không cấp dưỡng, tuy nhiên tổng lượng cồn tạo
ra tươngđương so với các tốc độ cấp dịch lớn hơn, khoảng 32g (Hình 3.12B).
3.3 Tiến hành sản xuất ở quy mơ phịng thí nghiệm (20L). Đánh giá chất
lượng của sản phẩm
Sau khi lựa chọn được quy trình đường hố và phương án lên men ở Nội
dung 2 (3.2), tiến hành sản xuất bia ở quy mơ phịng thí nghiệm (20L).
3.3.1 Sản xuất bia quy mô 20L
3.3.1.1. Sản xuất dịch đường lên men
Sử dụng 3kg gồm 2 loại malt (70% Pilsner + 30% Carabelge) để sản xuất dịch đường lên men. Hỗn hợp malt sau khi nghiền được phối với 15L nước 78oC (tỷ lệ malt : nước là 1 : 5) và tiến hành đường hố, đun sơi dịch đường với hoa theo chế độ đã chọn. Các chỉ tiêu khác của dịch đường trước khi lên men cũng được kiểm tra để đảm bảo chất lượng dịch đường phù hợp để tiến hành lên men bia: nồng độ chất hoà tan, pH, hàm lượng FAN, độ đắng (Bảng 3.3). Với chếđộ đun
62
thu được dịch đường có độ đắng là 16,57 IBU, đạt yêu cầu đặt ra. Tiến hành lên men với chủng Saccharomyces boulardii đã được hoạt hoá với mật độ nấm men cấp vào ban đầu là 107 tế bào/mL.
Bảng 3.3: Chất lượng dịch đường trước khi lên men
STT Chỉ tiêu Đơn vị Dịch trước lên men
1 Nồng độ chất hoà tan g/100mL 6,56 ± 0,03
2 pH 5,40 ± 0,01
3 Hàm lượng FAN mg/L 60,61 ± 0,73
4 Độđắng IBU 16,57 ± 0,27
5 Mật độ nấm men 107 tế bào/mL 1,085 ± 0,015
3.3.1.2. Lên men bia
Q trình lên men chính diễn ra trong 4 ngày, theo dõi pH và mật độ nấm
men trong suốt q trình lên men chính.
Kết quả theo dõi q trình lên men chính (Hình 3.13) cho thấy pH của dịch giảm dần trong quá trình lên men (từ 5,4 xuống 4,29) và gần như được duy trì ở
pH khoảng 4,3 từ ngày thứ 2 lên men. Mật độ nấm men tăng nhanh trong ngày đầu tiên lên men (từ 1,085×107 tế bào/mL lên 10,7×107 tế bào/mL), sau đó giảm dần do hết đường lên men, quá trình lên men giảm nên nấm men lắng xuống đáy thiết bị.
63 Sau khi kết thúc lên men chính, bia được đóng chai và tiếp tục lên men trong chai (bổ sung 0,8% đường saccharose vào chai) 4 ngày trước khi để vào tủ lạnh và bảo quản.
Hình 3.14: Sản phẩm bia chai
Các thơng số của bia trước khi đóng chai:
– Mật độ tế bào: 3,4×107 tế bào/mL. – Nồng độ cồn: 1,22% v/v.
– Độđắng: 16,36 IBU.
– pH: 4,29.
Chất lượng của bia sau 4 ngày lên men trong chai được thể hiện trong Bảng 3.4
Nồng độ chất hồ tan cịn lại được xác định bằng phương pháp đo tỷ trọng giống như xác định nồng độ chất hồ tan của dịch đường nhưng là với dịch cịn lại sau khi cất cồn. Lượng đường có thểlên men chính là lượng chất hồ tan giảm đi
sau q trình lên men. Nồng độ chất hồ tan trước khi lên men là 6,56g/100mL,
nồng độ chất hồ tan cịn lại sau lên men là 4,46g/100mL, nên lượng đường có thể lên men được là 2,1g/100mL, chiếm 32,02%, sai lệch không nhiều so với tỷ lệ 33,29% đã khảo sát được ở Nội dung 2 (3.2.1).
64
Bảng 3.4: Các chỉ tiêu của bia sau khi lên men trong chai 4 ngày
STT Chỉ tiêu Đơn vị Mẫu bia 1 Nồng độ chất hồ tan cịn lại g/100mL 4,46 ± 0,01 2 Nồng độ cồn % v/v 1,38 ± 0,03 3 Mật độ nấm men 107 tế bào/mL 6,90 ± 0,15 4 Hàm lượng CO2 % 0,52 ± 0,01