CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1.1 Phân lập và khảo sát các đặc điểm của chủng Saccharomyces
Phân lập chủng từ chế phẩm Bioflora
Thông qua phương pháp cấy vạch trên đĩa thạch môi trường YPD từ mẫu chế phẩm Bioflora 100mg (Biocodex, Pháp), thu được các khuẩn lạc của chủng (Hình 3.1).
Hình 3.1: Hình ảnh khuẩn lạc S.boulardii trên mơi trường
thạch YPD
Hình 3.2: Hình ảnh tế bào S.boulardii trong mơi trường YPD
lỏng
Khuẩn lạc của chủng S.boulardii thu được có các đặc điểm điển hình của
nấm men như: có màu trắng đục, nhẵn bóng, đường kính khoảng 2-3 mm, bề mặt
hơi lồi, rìa trịn (Hình 3.1). Khi qua sát dưới kính hiển vi, tế bào của chủng có dạng hình trứng hoặc hình bầu dục (Hình 3.2).
So sánh trình tự ITS thu được đối với khuẩn lạc phân lập được từđĩa thạch này (Phụ lục A1) với trình tự ITS của Saccharomyces cerevisiae thì thấy rằng sự tương đồng khoảng 99% (Phụ lục A2). Cùng với mơ tả về hình ảnh khuẩn lạc, có thể khẳng định rằng khuẩn lạc này là S.cerevisiae.
Đánh giá khả năng sử dụng đường galactose của chủng
Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng, Saccharomyces boulardii thực chất là một biến thể của Saccharomyces cerevisiae [58, 77], nhưng khảnăng sử dụng galactose
của S.boulardii kém hơn so với S.cerevisiae thông thường [63] nên trong nghiên
cứu này, để kiểm chứng chủng thu được có đúng là S.boulardii hay khơng, thí
48
Sau khi thu được khuẩn lạc, chủng được ni trong mơi trường có nguồn cacbon là D-galactose và D-glucose, tại 25oC, có lắc. Song song đó, làm tương tự
với chủng Saccharomyces cerevisiae được phân lập từ chế phẩm nấm men thương
mại SafAle US-05 (Fermentis, Lesaffre, Pháp). Theo dõi quá trình phát triển và sử
dụng đường của hai chủng để so sánh khảnăng dùng D-galactose của hai chủng.
Hình 3.3: Sự tăng trưởng của chủng phân lập từ Bioflora và chủng
S.cerevisiae SafAle US-05 trong mơi trường có nguồn dinh dưỡng cacbon là
D-galactose
Kết quả cho thấy (Hình 3.3), trong mơi trường có nguồn dinh dưỡng cacbon là D-galactose, chủng phân lập từ chế phẩm Bioflora sinh trưởng kém hơn hẳn so với chủng S.cerevisiae SafAle US-05. Mật độ của S.cerevisiae SafAle US-05 tăng
nhanh, đạt mật độ cao nhất là 15,35×107 tế bào/mL và giảm xuống cịn 11,5×107 tế bào/mL sau 48 giờsinh trưởng. Sự sinh trưởng của chủng phân lập từ Bioflora chậm hơn nhiều so với chủng S.cerevisiae SafAle US-05, mật độcũngtăng chậm và chỉ đạt 5,05×107 tế bào/mL sau 48 giờ. Kết quả này có nghĩa là khả năng sử
dụng đường galactose làm nguồn dinh dưỡng của chủng phân lập từ Bioflora kém
hơn so với S.cerevisiae.
Chủng phân lập từBioflora cũng có khả năng tiêu thụđường galactose kém
hơn so với đường glucose. Kết quảphân tích hàm lượng đường của mẫu theo thời gian trong vòng 24 giờ cho thấy khảnăng sử dụng hai loại đường này của chủng.
49
Hình 3.4: Sinh trưởng của chủng trong môi trường YPD-glucose
và YPD-galactose của S.boulardii
Đường glucose được chủng tiêu thụ nhanh chóng, trong khi đó, đường
galactose được tiêu thụ chậm hơn hẳn. Với cùng hàm lượng đường ban đầu 17,5g/L, đường glucose được chủng tiêu thụ nhanh chóng và hết sau 12 giờ, cịn
galactose thì được tiêu thụ chậm hơn hẳn (tiêu thụ khoảng 8g/L trong 24 giờ),
tương ứng với đó là sự sinh trưởng trong 12 giờ đầu của chủng trong mơi trường
có glucose nhanh hơn hẳn so với trong mơi trường có galactose.
Từ các kết quả thu được về khả năng tiêu thụ đường galactose, hình ảnh khuẩn lạc, giải trình tự ITS và cùng với các cơng bố của nhà sản xuất chế phẩm Bioflora, có thể khẳng định rằng chủng phân lập được từ chế phẩm là S.boulardii CNCM I-745.
Xây dựng đường cong sinh trưởng của chủng
Sau khi kiểm chứng được khuẩn lạc thu được từ chế phẩm là S.boulardii, chủng được nuôi trong môi trường YPD lỏng để xây dựng đường cong sinh trưởng. Chủng được nuôi trong 100mL môi trường YPD lỏng đã được tiệt trùng ở 110oC trong 30 phút, nuôi ở 25oC kèm với lắc 120 vòng/phút với mật độ nấm men ban
đầu là 106 tế bào/mL. Lấy mẫu theo thời gian để theo dõi mật độ tế bào nấm men, từđó lập nên đường cong sinh trưởng của chủng.
50
Hình 3.5: Đồ thị đường cong sinh trưởng của S.boulardii trong môi trường
YPD lỏng ở 25oC
Dựa vào đường cong sinh trưởng (Hình 3.5), ta có thể thấy chủng sẽ vào pha logarite sau 4 giờ, vào pha cân bằng sau 12 giờ và vào pha suy vong sau 26 giờ.
Trong điều kiện môi trường khác nhau thì tốc độ sinh trưởng của chủng sẽ khác nhau, tuy nhiên, có thể dựa vào đường cong sinh trưởng trên khi nhân giống chủng, sử dụng cho các thí nghiệm sau.
3.1.2 Ảnh hưởng của độ cồn và độ đắng tới sự phát triển của chủng
Saccharomyces boulardii
Để đánh giá được khả năng sử dụng chủng S.boulardii trong sản xuất bia, tiến hành các thí nghiệm đánh giá khảnăng sinh trưởng của chủng trong điều kiện
mơi trường có cồn và độ đắng (hai yếu tốđặc trưng cho môi trường bia, khác với
các môi trường nuôi cấy chủng thông thường).
Khuẩn lạc sau khi được hoạt hố trong mơi trường YPD lỏng ở 25oC trong 24 giờ sẽ tiến hành nuôi trong môi trường YPD có bổ sung thêm cồn và dịch chiết iso-α axit đắng theo các nồng độ khác nhau. Tiến hành lấy mẫu theo thời gian để
khảo sát sựsinh trưởng của chủng trong các điều kiện mơi trường này, từđó đánh giá được ảnh hưởng của cồn và độ đắng đến chủng.
Ảnh hưởng của nồng độ cồn
Nồng độ cồn trong bia thông thường khoảng 3-5% v/v. Nghiên cứu đang hướng tới một sản phẩm bia có nồng độ cồn thấp hơn nên sẽ tiến hành khảo sát cả
với các nồng độ cồn thấp. Đồng thời, để có thểđánh giá khái quát về chủng, đánh
51
độ cồn cao hơn cũng được đánh giá. Chủng được nuôi trong mơi trường có các nồng độ cồn (% v/v): 0, 2,5, 5 và 7,5.
Hình 3.6: Ảnh hưởng của cồn đến khả năng sinh trưởng của S.boulardii
Kết quả khảo sát (Hình 3.6) cho thấy, cồn có tác động tới sựsinh trưởng của chủng, nhưng ảnh hưởng của nồng độ cồn dưới 2,5% v/v là khơng có ý nghĩa về
mặt thống kê (p=0,603, mức chấp nhận α=0,05). Chủng có thể chịu được nồng độ
cồn 5-7,5% v/v, ảnh hưởng của các nồng độ cồn này đến chủng vẫn ở trong mức chấp nhận được (p=0,078, mức chấp nhận α=0,05). Kết quả này phù hợp với những nghiên cứu đã có về S.boulardii. Theo nghiên cứu của Senkarcinova và cộng sự, nồng độ cồn nhỏhơn 0,5% v/v không ảnh hưởng đến tốc độsinh trưởng riêng của
S.boulardii khi nuôi trong môi trường CM ở 30oC, tuy nhiên, nồng độ cồn càng
tăng thì tốc độsinh trưởng riêng càng giảm, tác động của cồn 2,5% v/v đến tốc độ sinh trưởng riêng là khơng có ý nghĩa về mặt thống kê [78]. S.boulardii có khả năng chịu cồn tốt ở 28oC với nồng độ cồn trong khoảng 6-8% v/v [79].
Ảnh hưởng của độ đắng
Khảnăng sinh trưởng của chủng được khảo sát ở các nồng độ đắng (IBU):
0, 10, 15, 20 và 25. Độ đắng thông thường trong bia công nghiệp khoảng 15-20 IBU. Sản phẩm bia có độ cồn thấp nên độđắng mong muốn trong sản phẩm cũng
sẽ thấp hơn so với các sản phẩm bia cơng nghiệp, vì thế thí nghiệm này khảo sát cả các nồng độđắng nhỏhơn.
52
Hình 3.7: Ảnh hưởng của độ đắng đến khả năng sinh trưởng của S.boulardii
Độđắng có tác động tới sựsinh trưởng của chủng, ở các mơi trường có độ đắng 10-25 IBU, mật độ tế bào nấm men ở pha cân bằng thấp hơn so với môi
trường khơng có độđắng, tuy nhiên, sựảnh hưởng này là khơng đáng kể và khơng
có ý nghĩa về mặt thống kê (p=0,973, mức chấp nhận α=0,05) (Hình 3.7). Kết quả
này giống với kết quả nghiên cứu của Senkarcinova và cộng sự [78].
Từ kết quả của khảo sát này, có thể đánh giá được rằng, Saccharomyces
boulardii có thểđược sử dụng trong sản xuất các loại bia tương tựnhư một chủng
nấm men lên men nổi.
3.2 Nghiên cứu kỹ thuật đường hoá và lên men tạo bia nồng độ cồn thấp
và lượng sinh khối cao bằng chủng Saccharomyces boulardii
Với mong muốn tạo ra một sản phẩm có nồng độ cồn thấp và có chứa sinh khối nấm men probiotic S.boulardii, các phương pháp vật lý để sản xuất bia
NABLAB được xem là không khả thi để thực hiện (vì sẽ tác động xấu tới nấm men). Vì thế, các phương pháp sinh học đã được lựa chọn để nghiên cứu trong đề
tài này, cụ thể là kỹ thuật đường hoá và lên men. Chọn nguyên liệu malt
Hai loại malt được sử dụng để sản xuất dịch đường lên men là Pilsner và
Carabelge (Weyermann, Đức). Pilsner là loại malt nền được sử dụng phổ biến trong sản xuất bia. Carabelge là loại malt có hương thơm và vị caramel nhẹ, hương
vị trái cây. Xác định một số chỉtiêu cơ bản của hai loại malt trước khi sử dụng: độ ẩm, độhoà tan và độ màu.
53
Carabelge là dịng malt đặc biệt, mục đích sử dụng chính là tạo màu và
hương vịđặc biệt cho sản phẩm nên độ hoà tan của malt (71,43%) thấp hơn so với các loại malt nền là Pilsner (78,61%). Các loại malt nền là các loại malt cung cấp chất hồ tan chính trong dịch đường lên men nên có độ hồ tan cao (78-80%), loại
malt Pilsner được sử dụng trong nghiên cứu có độ hoà tan là 78,61%, hoàn toàn
đáp ứng được yêu cầu trong sản xuất.
Bảng 3.1: Một số chỉ tiêu của malt
STT Chỉ tiêu Đơn vị Pilsner Carabelge
1 Độẩm % 6,31 6,23
2 Độ hoà tan % 78,61 71,43
3 Độ màu EBC 5,47 36,05
Hình 3.8: Dịch chiết thu được từ hai loại malt
(1 – Malt Pilsner; 2 – Malt Carabelge)
Với mong muốn tạo ra dịch đường có màu vàng đậm như màu mật ong,
nghiên cứu đã kết hợp cả hai loại malt để sử dụng trong sản xuất dịch đường của toàn bộ nghiên cứu. Để đảm bảo chất lượng của dịch đường vẫn đạt những tiêu chuẩn cơ bản để lên men, tỷ lệ sử dụng malt Carabelge được khuyến cáo sử dụng là 30%. Vì thế, tỷ lệ hai loại malt được lựa chọn sử dụng trong toàn bộ nghiên cứu là 70% malt Pilsner và 30% malt Carabelge.
3.2.1 Nghiên cứu kỹ thuật đường hoá
Căn cứ vào tác động của nhiệt độ tới các enzym thuỷ phân tinh bột thành
đường trong malt để lựa chọn ra chếđộđường hoá phù hợp, tạo ra được dịch đường có tỷ lệđường lên men được như mong muốn. Phổ các loại đường trong dịch lên men phụ thuộc vào hoạt động của các enzym trong malt, thuỷ phân tinh bột thành
54
đường trong q trình đường hố. ꞵ-amylase tạo ra đường có thể lên men được (chủ yếu là maltose) có nhiệt độ tối ưu là 62-65oC, trong khi đó, α-amylase tạo ra
đường không lên men (chủ yếu là dextrin) có nhiệt độ tối ưu là 72-75oC [7]. Chính vì thế, việc điều chỉnh nhiệt độ và thời gian giữ nhiệt trong q trình đường hố là
cách điều chỉnh phổđường trong dịch lên men, từđó điều chỉnh được nồng độ cồn trong sản phẩm.
Với mong muốn tạo ra dịch đường lên men có hàm lượng đường lên men
được thấp, bốn chếđộđường hoá ở nhiệt độcao sau đã được khảo sát: – Chếđộ 1: giữ tại 72oC trong 60 phút. – Chếđộ 2: giữ tại 72oC trong 45 phút. – Chếđộ 3: giữ tại 72oC trong 30 phút. – Chếđộ 4: giữ tại 78oC trong 30 phút. Bảng 3.2: So sánh các chế độ đường hoá STT Các chỉ tiêu Đơn vị 72 oC/60 phút 72oC/45 phút 72oC/30 phút 78oC/30 phút 1 Hàm lượng maltose + glucose g/100mL 7,67 7,40 6,20 4,26
2 Độ hoà tan ban đầu g/100mL 15,06 14,87 14,46 13,94
3 Độ hoà tan cuối g/100mL 7,40 7,43 8,26 9,30
4 Lượng đường đã lên men g/100mL 7,90 7,48 6,26 4,64
5 Tỷ lệđường đã lên men % 52,46 50,30 43,29 33,29
6 Nồng độ cồn % v/v 3,54 3,31 3,25 2,58
7 Hàm lượng FAN mg/L 190,21 183,47 176,00 165,35
Nhiệt độđường hố là yếu tố có tác động lớn tới hàm lượng các loại đường
được tạo ra trong quá trình này, do nhiệt độ cao làm hoạt tính của enzym bị suy giảm nhanh [80]. Theo kết quả nghiên cứu của Evans và cộng sự, với nhiệt độ trên 75oC, lượng đường maltose được tạo ra ít, chiếm khoảng 50% (thấp hơn so với
68% khi đường hoá ở 65oC), đồng thời, các thành phần không lên men được tăng
[81]. Kết quả của khảo sát (Bảng 3.2) cũng cho thấy kết quảtương tự. Khi đường hố ở nhiệt độ 72oC, lượng đường có thểlên men được (chênh lệch giữa độ hoà
55
tan ban đầu của dịch trước lên men và độ hoà tan cuối sau khi lên men, chủ yếu là
đường maltose và glucose) chiếm khoảng 43,29-52,46% lượng chất hoà tan trong dịch, và giảm xuống cịn 33,29% khi đường hố ở nhiệt độcao hơn là 78oC. Đây
là tỷ lệđường lên men được phù hợp với mục tiêu của nghiên cứu. Tuy nhiên, hàm
lượng nito amin tự do trong dịch thu được từ chếđộ đường hoá ở 78oC thấp hơn
so với các chếđộ còn lại (165,35mg/L). Đây là nguồn dinh dưỡng cho nấm men
phát triển. Thông thường, hàm lượng FAN trong dịch đường trong khoảng 100-
120mg/L là cần thiết để nấm men phát triển (phụ thuộc vào nồng độ chất hồ tan trong dịch) [74]. Vì thế, chất lượng dịch đường thu được từ chếđộ đường hoá này
hoàn toàn đáp ứng yêu cầu để lên men, nên nghiên cứu lựa chọn chếđộđường hoá 78oC trong 30 phút để sản xuất dịch đường lên men tạo sản phẩm bia có nồng độ
cồn thấp.
Theo kết quả của khảo sát (Bảng 3.2), dịch đường thu được từ chếđộ đường hố 78oC trong 30 phút có nồng độ hoà tan là 13,94g/100mL (tương ứng với 13,25oP), tỷ lệđường lên men được là 33,29%, sau khi lên men sẽthu được dịch có nồng độ cồn là 2,58% v/v. Đểđạt được mục tiêu đề tài là tạo ra sản phẩm bia có nồng độ cồn thấp, khơng q 2% v/v, nồng độ chất hoà tan ban đầu của dịch lên men cần phải thấp. Tuy nhiên, nồng độ chất hoà tan trong dịch đường lên men không nên quá thấp, do lượng đường không thể lên men trong dịch đường có ảnh
hưởng đến hậu vị của sản phẩm. Thông thường, hàm lượng chất hoà tan trong bia sẽ khoảng 3-4oP để hậu vị của sản phẩm không bị nhạt và người tiêu dùng không bị cảm giác “sốc” cồn khi uống. Với tỷ lệđường lên men được là 33,29% thì nồng
độ chất hồ tan ban đầu xác định khoảng 5-6oP, khi đó, hàm lượng chất hoà tan trong bia dự kiến khoảng 4oP, đảm bảo hậu vị cho sản phẩm. Muốn thu được nồng
độ chất hoà tan như vậy, tỷ lệmalt : nước phối trộn trước khi đường hoá là 1 : 5 và sau khi đường hoá, tiến hành lọc, rửa bã đến khi thu được dịch đường có nồng
độ chất hoà tan như mong muốn.
3.2.2 Nghiên cứu kỹ thuật lên men
Các phương án lên men: lên men theo mẻ không cấp dưỡng (batch fermentation) và lên men cấp dưỡng (fed-batch fermentation) được khảo sát trên dịch đường thu được từ chế độ đường hoá 78oC, 30 phút, lọc và rửa bã đến khi nồng độ chất hoà tan khoảng 5-6oP và được đun sôi với hoa houblon trong 1 giờ. Vì sản phẩm khơng đặt ra u cầu vềhương thơm đặc trưng nên hoa houblon được lựa chọn là hoa viên Saaz (Czech). Đây là loại hoa viên được sử dụng phổ biến trong sản xuất các loại bia nhẹnhư Pilsner và các loại bia Lager nói chung. Mục
56
đích của nghiên cứu này là muốn tìm ra phương án lên men để giảm lượng cồn tạo
thành và tăng lượng sinh khối nấm men sinh ra trong quá trình lên men. Tuy nhiên, phải kết hợp với cả chất lượng cảm quan của sản phẩm thu được để chọn phương
án lên men tạo sản phẩm cuối cùng.
3.2.2.1. Lên men theo mẻ không cấp dưỡng
Chủng Saccharomyces boulardii được lên men theo mẻ không cấp dưỡng và lấy mẫu theo dõi trong 24 giờ. Sự chuyển hoá đường maltose, glucose, sinh khối