Tổng quan về kỹ thuật nuôi cấy mô thực vật

2.2 Tổng quan về dừa sáp

2.2.5 Tổng quan về kỹ thuật nuôi cấy mô thực vật

2.2.5.1 Khái niệm về nuôi cấy mô thực vật

Nuôi cấy mô thực vật, cịn được gọi là ni cấy tế bào, In-vitro, axenic hoặc vô trùng, là một công cụ quan trọng trong cả nghiên cứu cơ bản và ứng dụng trong thương mại. Nuôi cấy mô thực vật là nuôi cấy vô trùng các tế bào, mô, cơ quan và các thành phần của chúng trong các điều kiện vật lý và hóa học được xác định trong ống nghiệm.

Theo American Psychological Association (2010): In-vitro là phương pháp nghiên cứu đối với các vi sinh vật, tế bào, hoặc các phân tử sinh học trong điều kiện trái ngược với bối cảnh sinh học bình thường của chúng, được gọi là "thí nghiệm trong ống nghiệm". Các nghiên cứu về sinh học và các tiểu ngành được thực hiện bằng thiết bị phịng thí nghiệm như ống nghiệm, bình, đĩa Petri và các đĩa vi tinh thể, bằng cách sử dụng các mô của một sinh vật bị tách khỏi môi trường sinh sống thông thường. Cách này cho phép phân tích chi tiết hơn hoặc thuận tiện hơn so với các sinh vật khác.

B A

Tuy nhiên, các kết quả thu được từ các thí nghiệm trong ống nghiệm có thể khơng dự đốn đầy đủ hoặc chính xác tác động trên tồn bộ cơ thể.

2.2.5.2 Khái niệm về nhân giống in-vitro và các hệ thống nuôi cấy mô

Phương pháp nhân giống in-vitro thực chất là một tiến bộ vượt bậc của các phương pháp nhân giống vơ tính cổ điển như giâm cành, giâm chồi, chiết, ghép, tách dòng… Ở đây giá trị thực tiễn của các tiến bộ khoa học kỹ thuật là đã biến những phương thức cổ điển đó thành những phương thức hồn tồn mới về chất cho phép giải quyết những khó khăn mà phương pháp cổ điển không thể vượt qua (Bonga and Aderkas, 1992).

Nuôi cấy mô (tissue culture) là thuật ngữ dùng để chỉ q trình ni cấy vơ trùng in-vitro các bộ phận tách rời khác nhau của thực vật. Kỹ thuật nuôi cấy mơ dùng cho cả hai mục đích nhân giống và cải thiện di truyền.

Thuật ngữ nhân giống in-vitro (in-vitro propagation) hay còn gọi là vi nhân giống (micropropagation) được sử dụng đặc biệt cho việc ứng dụng các kỹ thuật nuôi cấy mô để nhân giống thực vật, bắt đầu bằng nhiều bộ phận khác nhau của thực vật có kích thước nhỏ, sinh trưởng ở điều kiện vô trùng trong các ống nghiệm hoặc trong các loại bình ni cấy khác.

Trong thực tế, các nhà vi nhân giống (micropropagators) dùng thuật ngữ nhân giống in-vitro và nuôi cấy mô thay đổi cho nhau để chỉ mọi phương thức nhân giống thực vật trong điều kiện vô trùng. Thuật ngữ đồng nghĩa là nuôi cấy in-vitro (in-

vitro culture).

Nhân giống in-vitro và nuôi cấy mô bắt đầu bằng các mảnh cắt nhỏ của thực vật, sạch vi sinh vật, và được nuôi cấy vô trùng. Thuật ngữ đầu tiên dùng trong quá trình nhân giống là mẫu vật (explant) tương đương với các phương thức nhân giống khác là giâm cành (cutting), chiết cành (layer), ghép cành (scion) hoặc hạt (seed). Năm thuật ngữ khác được dùng để chỉ các loại tái sinh sinh dưỡng (vegetative or somatic regeneration) cơ bản trong nhân giống in-vitro và nuôi cấy mô.

2.2.5.3 Nhân giống bằng phơi vơ tính và phơi hữu tình - Phơi vơ tính:

Một phương thức nhân giống vơ tính là tạo phơi vơ tính từ tế bào mơ sẹo. Murashige (1977), cho rằng phơi vơ tính có thể trở thành một biện pháp nhân giống in-vitro. Ở một số loài, sự phát sinh phơi vơ tính hình thành trực tiếp từ những phơi bất định (adventitious embryos) nằm trong phôi tâm (nucellar embryos). Đến nay, cơng nghệ phơi vơ tính được coi là cơng nghệ rất có triển vọng cho nơng nghiệp trong thế kỷ 21.

- Phơi hữu tính

Ở trường hợp phơi hữu tính, sự kết hợp giao tử đực và cái cho ra hợp tử (zygote). Hợp tử phân chia nhiều lần tạo nên phơi hữu tính có cấu trúc hai cực: rễ và ngọn. Khi hợp tử phát triển, miền sinh trưởng rễ và miền sinh trưởng ngọn cùng phát triển và cuối cùng tạo thành cây hồn chỉnh, qua các giai đoạn phơi học như sau:

- Trường hợp cây hai lá mầm: Dạng cầu → dạng thủy lơi → dạng có lá mầm. - Trường hợp cây một lá mầm: Dạng cầu → dạng scutellar → dạng diệp tiêu. Một số thành công ở lĩnh vực này: Trên cây thuộc họ citrus của Steven (1966), Jumin và Nito (1996). Trên cây thuộc họ Theobroma Cacao Litz (1986) của Alemanno et al. (1996b)

2.2.5.4 Cơ sở khoa học kỹ thuật nuôi cấy phôi

Nuôi cấy phôi, đôi khi được gọi là giải cứu phôi, là một trong những kỹ thuật trong ống nghiệm đã được sử dụng trong hơn nửa thế kỷ để cứu sản phẩm lai của thụ tinh khi chúng có thể thối hóa.

Sự ghi nhận đầu tiên về ni cấy phơi là cơng trình của Charles Bonnet ở thế kỷ XVIII. Ơng tách phơi Phascolus và Fagopyrum trong đất và nhận được cây nhưng là cây lùn. Từ đầu thế kỷ XX các cơng trình ni cấy phơi dần được hồn thiện hơn. Từ

các cơng trình nghiên cứu trước đó, vào năm 1922 Knudson đã ni cấy thành công phôi cây lan trong môi trường chứa đường và khám phá ra một điều là nếu thiếu đường thì phơi khơng thể phát triển thành protocom.

Raghavan (1976) đã công bố rằng, phôi phát triển qua hai giai đoạn dị dưỡng và tự dưỡng. Ở giai đoạn dị dưỡng (tiền phơi) cần có các chất điều hịa sinh trưởng để phát triển. Trong giai đoạn tự dưỡng sự phát triển của phơi khơng cần chất điều hịa sinh trưởng.

Van Overbeek et al. (1941) phát hiện ra rằng, phơi lai Datura có thể được ni cấy trong mơi trường ni cấy có chứa nước dừa. Khám phá này cuối cùng đã dẫn đến sự hiểu biết về tầm quan trọng của việc giảm N dưới dạng acid amin đối với nuôi cấy phôi.

Từ đầu những năm 1940, nuôi cấy phôi đã được sử dụng ngày càng nhiều để hiểu các yêu cầu về thể chất và dinh dưỡng cho phôi phát triển, bỏ qua ngủ đông hạt giống, rút ngắn chu kỳ sản xuất, thử nghiệm khả năng sống của hạt giống, cung cấp nguyên liệu cho vi nhân giống và cứu hộ phôi lai chưa trưởng thành từ lai khơng tương thích (Hu and Wang, 1986).

Một số lồi sản xuất hạt vơ trùng. Vơ trùng hạt giống có thể là do sự phát triển phơi khơng hồn chỉnh (ví dụ: Các giống chín sớm của Quả Prunus), đột biến cấu trúc bao phủ phôi dẫn đếncái chết của phơi nảy mầm (ví dụ: Dừa Sáp) hoặc recalcitrant loại ngủ đơng mà chưa có phương pháp giải phóng ngủ đơng nào được phát triển (ví dụ:

Chuối). Kỹ thuật nhân giống bằng phương pháp ni cấy phơi có thể mang lại cây con khả thi trongnhững trường hợp như vậy.

2.2.5.5 Điều kiện cần thiết của ni cấy mơ in-vitro

Nhiệt độ: Nhiệt độ có tác động trên sự tăng trưởng do tác động trên sự quang

hợp, cá phản ứng biến dưỡng, sự hấp thu vận chuyển nước và các chất khống. Nhiệt độ phịng ni cấy mô thường được điều chỉnh ổn định từ 22-250C. Tuy nhiên, tuỳ từng loại nuôi cấy và đối tượng ni cấy mà có sự điều chỉnh thích hợp. Nguyễn Văn Việt (2017), nhiệt độ thích hợp ni cấy lan hồng thảo kèn là 24±20C, Đoàn Thị Mai và ctv. (2009) nhiệt độ phịng ni cấy thích hợp cho cây keo là khoảng 25-280C, Trương Quốc Ánh và ctv. (2012) nhiệt độ thích hợp của phịng ni cấy mơ dừa sáp cấy phôi là 28± 20C.

Cường độ ánh sáng: Ánh sáng đóng vai trị quan trọng trong việc tạo hình cây

In-vitro, nó tác động đến các q trình quang hợp và hơ hấp của cây. Ánh sáng cịn góp

phần vào việc tạo rễ và chồi bất định của các phôi. Khi thiếu ánh sáng cây sẽ bị vàng hoá do lá thiếu diệp lục tố vì quang hợp khơng xảy ra dẫn đến hậu quả là cây sẽ giảm khối lượng, việc phân hố mơ và tạo rễ sẽ giảm.

Theo Đỗ Mạnh Cường và ctv. (2015), thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày đối với lan gấm. Đoàn Thị Mai và ctv. (2009) cho rằng, cường độ ánh sáng 2.000-3.000 lux, số giờ chiếu sáng 10h/ngày thích hợp cho ni cấy mơ cây keo. Còn theo Trương Quốc Ánh và ctv. (2012), cường độ ánh sáng thích hợp cho cây dừa cấy phôi là 4.000 lux, thời gian chiếu sáng 9h/ngày.

Ẩm độ: Độ ẩm cần thiết trong nuôi cấy In-vitro khoảng 95% do độ ẩm

ảnh hưởng tới hình thái, cấu trúc và sinh lý của mơ cấy. Độ ẩm giúp tạo áp suất thuỷ tĩnh, giảm bớt nhiệt độ dao động trong bình cấy, giúp vận chuyển các chất trong cơ thể thực vật… Khi độ ẩm trong bình cấy mơ q cao sẽ gây ra sự bão hồ hơi nước trong bình cấy mơ làm cho lớp cutin mỏng, hiện tượng thuỷ tinh thể xảy ra dẫn đến sự giảm năng suất khi đưa cây ra mơi trường ngồi. Theo Đỗ Mạnh Cường và ctv. (2015), ẩm độ thích hợp cho cây ni cấy mô là 50-60%.

Độ pH: Độ pH phù hợp trong nuôi cấy phôi dừa sáp trong khoảng từ 5,8-6.

Trong môi trường nuôi cấy nếu pH chưa phù hợp thì nó có xu hướng dịch chuyển về pH phù hợp để mơ có thể phát triển được. Khi sử dụng các loại phụ gia có tính kiềm hoặc tính acid cao như amino acid, vitamin thì dùng NaOH hoặc HCl lỗng để chỉnh pH.

Kết quả nghiên cứu ni cấy phơi dừa sáp tại trường Đại học Trà Vinh cho thấy điều kiện phù hợp cho cây phát triển là phịng ni cây có nhiệt độ 30oC, ẩm độ 60% và cường độ chiếu sáng 2.000-2.500 lux, pH môi trường 5,6 (Phạm Thị Phương Thúy, và ctv., 2016).

2.2.5.6 Các phương pháp hạn chế mầm bệnh: Vô trùng dụng cụ và môi trường:

- Các dụng cụ thuỷ tinh dùng trong các thí nghiệm thường được xử lý bằng dung dịch sulflocromate một lần trước khi đưa vào sử dụng; về sau chỉ cần rửa sạch bằng xà phòng, tráng sạch bằng nước cất và để thật ráo trước khi sử dụng.

- Các dụng cụ thuỷ tinh dùng trong các thí nghiệm ni mơ và tế bào thực vật địi hỏi vơ trùng, có thể khử trùng trong tủ sấy ở nhiệt độ cao trong nhiều giờ. Các dụng cụ này ln được gói trong giấy nhơm hoặc hộp kim loại để tránh bị nhiễm trở lại sau khi đã khử trùng.

- Môi trường nuôi cấy được hấp khử trùng trong nồi hấp (autoclave), khử trùng trong bằng áp suất hơi nước bão hoà. Thời gian hấp từ 15-30 phút ở áp suất hơi nước bão hoà là 103,4 kPa (1atm) tương đương với nhiệt độ 121oC. Ở nhiệt độ 121oC, hầu hết các vi sinh vật có trong mơi trường đều bị tiêu diệt, kể cả dạng bào tử. Sau khi vô trùng cần phải làm khô nắp ống nghiệm hoặc nút nông để tránh nhiễm trở lại (Đỗ Mạnh Cường và ctv., 2015).

Khử trùng bề mặt:

- Các chất khử trùng bề mặt thường được dùng trong 10 đến 15 phút. Ở điều kiện vô trùng, dung dịch khử trùng sau đó được bỏ và vật liệu thực vật được rửa 3 hoặc 4 lần, 5 phút mỗi lần bằng cách lắc trong nước cất vô trùng. Rửa nước cất rất quan trọng để loại bỏ các chất khử trùng gây tác động ức chế sự phát triển của cây trong giai đoạn vô mẫu (Trần Văn Minh, 2017) như:

- Ethanol (cồn): Cồn là một chất khử trùng bề mặt phổ biến để diệt vi khuẩn và nấm, cồn thường được rửa trước khi áp dụng các phương pháp khử trùng bề mặt khác. - Dung dịch hypochlorite, tiếp xúc 10-15 phút để khử trùng bề mặt. Sau khi xử lý hypochlorit, vật liệu cây trồng được rửa kỹ với nước cất vơ trùng để loại bỏ hồn tồn chất khử trùng.

Khử trùng nơi thao tác và dụng cụ cấy:

- Nguồn tạp nhiễm quan trọng và thường xuyên nhất là bụi rơi vào dụng cụ thuỷ tinh chứa môi trường trong khi mở nắp hoặc nút bông để thao tác cấy. Người ta áp dụng các biện pháp khác nhau đế chống lại nguồn tạp nhiễm này. Phịng ni cây thường là buồng có diện tích hẹp, rộng từ 10-15m2, Có hai lớp cửa để tránh khơng khí chuyển động từ bên ngồi trực tiếp đưa bụi vào. Sàn được lát gạch men để có thể lao chùi thường xuyên. Trước khi đưa vào sử dụng phòng cần được xử lý formol cho bốc hơi tự do trong 24h; sau đó loại bỏ hơi formol bằng dung dịch NH3 25% cũng trong 24h. Bề mặt nơi chuẩn bị cấy, bề mặt bên trong và ngoài tủ cấy phải được khử trùng trước khi cấy bằng cách lau sạch các bề mặt này bằng cồn 90% (Trần Văn Minh, 2017).

- Tia UV cũng có thể được sử dụng để khử trùng bề mặt phòng cấy và bề mặt phòng cấy và tủ cấy nhưng nó ít hiệu quả hơn và gây nguy hiểm hơn là sử dụng cồn. Tia UV chỉ tiêu diệt được các mầm vi sinh nằm trực tiếp ngay trên các bề mặt mà tia này chiếu vào, nhưng nó khơng thể thấm qua các lớp bụi để tiêu diệt các vi sinh vật nằm bên dưới lớp bụi này.

- Các dụng cụ mang vào phịng cấy đều vơ trùng trước: từ áo choàng, mủ vải, khẩu trang của người cấy đến dao, kéo, kẹp (forceps), giấy lọc, bình đựng nước cất… Trên bàn thường xuyên có một đèn cồn để sử dụng trong khi cấy và một cốc đựng cồn 90% để nhúng các dụng cụ làm việc. Trước khi cấy, người cấy cần rửa tay bằng xà phòng và lau đến khuỷu tay bằng cồn 90%.

- Các dụng cụ bằng kim loại như kẹp cấy, dao mổ, mũi kim nhọn có thể được khử trùng bằng cách đốt dưới ngọn đèn cồn. Những dụng cụ này trước hết phải được nhúng vào cồn tuyệt đối rồi mới đốt.

2.2.5.7 Trang thiết bị

- Cân 4 số lẻ: Cân được thiết kế tinh tế cho phép thực hiện các phép đo nhanh và cho kết quả chính xác cao với sai số cực nhỏ mà các cân truyền thống không thể thực hiện được. Điều này đặc biệt quan trọng trong phịng thí nghiệm khi địi hỏi sự chính xác của các chất trong thành phần môi trường nuôi cấy phôi dừa sáp.

- Máy cất nước 2 lần: dùng để chưng cất nước, tạo ra nước tinh khiết bằng cách chưng cất nước 1 hoặc 2 lần. Quá trình chưng cất dùng nhiệt để đun nước, làm nước bay hơi và ngưng tụ. Nước thu từ việc làm bay hơi và ngưng tụ này được gọi là nước cất.

- Máy lọc nước: hoạt động theo một quy trình khép kín, nhờ sự hỗ trợ của các cấp lọc thô, màng lọc và các lõi lọc nâng cấp bổ sung chất khống khơng những làm sạch nước, loại bỏ các tạp chất hữu cơ và clo dư mà cịn giúp loại bỏ tồn bộ vi khuẩn và virut trong nước làm cho nguồn nước sạch trở lại.

- Tủ sấy: tủ sấy được sử dụng để sấy khô, diệt khuẩn và tiệt trùng các dụng cụ trong phịng thí nghiệm, hoặc đơn giản là một công đoạn cần thiết để diễn ra phản ứng hóa, lý mong đợi.

- Tủ cấy: được sử dụng cho các thí nghiệm cần thực hiện trong mơi trường sạch nghiên cứu, thí nghiệm lâm sàng các tế bào, vius, nuôi cấy, theo dõi các tế bào động vật, thực vật, thí nghiệm các mẫu thực phẩm, dược phẩm.