phương pháp In-vitro trên thế giới và Việt Nam
2.3.1 Nhân giống trong bằng phương pháp truyền thống:
Việc chọn, tạo và sản xuất giống dừa hiện nay, cây giống được tạo ra theo phương pháp truyền thống là chọn trái không sáp trong cùng một quày có trái sáp đem ươm như các giống dừa khác và được người dân tự thực hiện.
Chọn giống: Nhân giống dừa sáp chủ yếu bằng trái, dừa làm giống được tuyển chọn từ những cây đầu dòng trên 10 năm tuổi, cây dừa có sáp, khoẻ mạnh, khơng bị bệnh. Chọn buồng nhiều trái, trái to, màu sắc đẹp (lưu ý chọn trái dừa nước) nếu chọn trái sáp thì trái khơng nảy mầm.
Trái dừa hái xuống, treo lên dây phơi khơ, sau đó vạt mặt, xếp xuống đất hoặc cho vào bịch nylon có chứa xơ dừa + phân chuồng, đưa vào vườn ươm.
Làm giàn lưới để che bớt ánh sáng, ngày tưới 1 lần, mùa mưa không cần tưới. Sau khi đưa vào vườn ươm khoảng 35 ngày, trái nảy mầm. Khi nảy mầm, dùng phân bón lá phun kích thích cho lá và rễ phát triển. Tiếp tục chăm sóc thêm 25 ngày, khi cây dừa cao 50cm và rễ đâm ra khỏi vỏ dừa.
Ở Việt Nam áp dụng phương pháp nhân giống dừa Sáp phổ biến là: Ươm trái và ni cấy phơi hữu tính. Phương pháp ươm trái là sử dụng trái khơng sáp trên qy dừa có trái sáp để ươm thành cây, với phương pháp này cây giống tạo ra có tỷ lệ trái sáp/quày thấp (< 25%) (Võ Văn Long, 2007).
2.3.2 Nhân giống bằng phương pháp in-vitro
2.3.2.1 Nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô
Phôi soma là phôi hình thành từ các bộ phận cơ quan sinh trưởng của cây có cùng bản chất với phơi hữu tính nhưng chúng hồn tồn khơng trải qua quá trình thụ tinh mà thành.
Các nghiên cứu hiện nay cho thấy rằng việc nhân giống vơ tính cây dừa với các mẫu cấy khác nhau đều thơng qua sự tạo thành phơi vơ tính với môi trường cơ bản là Y3 với hàm lượng cao 2,4-D (Perera et al., 2009b).
Theo Fernando and Gage (2000), cho thấy ảnh hưởng của BA đến q trình cảm ứng tạo phơi soma của dừa sáp từ mô sẹo như sau:
+ Trong mơi trường 72 (BM 72) có bổ sung 24µM 2,4-D; 2,5 đến 7,5µM BA và 2,5g than hoạt tính ni cấy từ 2 đến 3 tháng trước khi ni cấy tái sinh, có 50% số sẹo được phát sinh phơi.
+ Trong mơi trường có sử dụng một nồng độ 2,4-D giảm dần và kèm theo có bổ sung BA với nồng độ từ 2,5 đến 5 µM, chu kì cấy chuyền 5 tuần 1 lần, ở nồng độ từ 24 xuống 16 µM 2,4-D cho kết quả cảm ứng tạo phôi tương ứng là 61,14% và 11,4% cảm ứng chồi và ở nồng độ 2,4-D 2,5 và 7,5 µM với bổ sung BA cho kết quả cảm ứng tạo phôi là 67,4 và tỷ lệ cảm ứng chồi là 9,4%, ở nồng độ 7,5 cho tỷ lệ cảm ứng phơi là 73,7% cịn tỷ lệ cảm ứng chồi là 0% (Fernando et al., 2010).
+ Ngoài ra Fernando và Gage (2000) cịn cho thấy kích thước phơi lớn hơn cho tỷ lệ tạo sẹo tốt hơn.
Theo Samosir (1999) cho thấy môi trường Y3 với sự bổ sung 600 µM 2,4-D cho tạo mơ sẹo và mơi trường cảm ứng phơi mơ sẹo thì bổ sung 6 µM 2,4-D và 300 µM BA.
Theo Toan and Thanh, (2011) cho thấy đã tạo được mô sẹo trên môi trường Y3 đã thêm NAA 4 mg/L + BA 8 mg/L sau 3 tháng nuôi cấy. Tuy nhiên, đến nay chưa thành công trong việc chuyển đổi từ phôi soma sang cây con.
2.3.2.2 Nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy phôi
Nguyên nhân trái dừa sáp không nảy mầm: Trong tự nhiên trái dừa có sáp
khơng phát triển thành cây. Phơi dừa sáp như dừa thường về mặt hình thái, nhưng khơng nảy mầm do các đặc tính sinh hóa và sinh lý khơng bình thường của phơi đã ngăn cản sự nảy mầm của nó. Theo Abraham et al. (1965) chỉ ra rằng, phôi dừa sáp thường lớn hơn phôi dừa thường và tiếp tục phát triển bên trong trái mà không nảy mầm, các nguyên nhân chính cho thấy tần số cao của các tế bào đa bội nhỏ bất thường được tìm thấy trong nội nhũ trái dừa sáp. Theo Cruz and Ramirez (1968), sự nhân lên một cách không tổ chức của các tế bào (microcell, có hình dạng khơng hệ thống bởi kỳ phân chia tế bào chất (cytokinesis) bất thường dẫn đến sự tăng sinh khơng kiểm sốt của mô nội nhũ làm mất kết nối giữa nội nhũ và giát mút (haustorium), kết quả mô không thể nuôi dưỡng sự phát triển của phôi trong q trình nảy mầm. Ngồi ra, do sự thiếu hụt của các enzyme α-D-alactosidase và mannosidase có liên quan đến khả năng tích lũy galactomannan, điều này đã ngăn chặn việc hình thành các polysacarit chun biệt khác, do đó ngăn cản sự nảy mầm (Mujer et al., 1983, Mujer et al., 1984). Ngồi ra, hoạt động của enzyme mannanase đã được tìm thấy trong nội nhũ dừa sáp cao hơn trong nội nhũ bình thường, dẫn đến galactomannan ít nhớt hơn (Samonte et al., 1989). Người ta tin rằng những thay đổi trong cân bằng enzyme được ghi nhận trong nội nhũ dừa sáp (Mujer et al., 1983, Mujer et al., 1984) có thể là kết quả của việc xác định sai gen mã hóa cho các enzyme đó (Ramirez, 1991). Từ các nguyên nhân trên, dẫn đến trái dừa có sáp khơng nảy mầm.
Để phát triển cây giống dừa sáp thuần chủng (đồng hợp tử lặn), cách duy nhất, là thông qua nuôi cấy trong ống nghiệm (kỹ thuật cứu phơi). Cây giống này có thể tạo ra trái dừa sáp với tỷ lệ tuyệt đối 100% (Guzman and Rosario, 1964).
2.3.2.3 Những nghiên cứu nhân giống dừa sáp bằng phương pháp nuôi cấy phôi trên thế giới và Việt Nam
- Phương pháp nuôi cấy phôi dừa sáp trên thế giới
Bước đầu trong nhân giống dừa sáp từ phôi: Nuôi cấy phôi dừa sáp lần đầu tiên được thực hiện cách đây hơn năm thập kỷ do Abraham và Thomas (1962) và đã đạt được hai năm sau đó khi Guzman và Rosario (1964) sử dụng môi trường cơ bản được tạo bởi White (1943) và Nitsch (1951).
Từ những năm 1960, nhóm nghiên cứu của trường đại học Philipine tại Los Banos do Guzman dẫn đầu đã nghiên cứu và chứng minh được phơi dừa sáp sau khi tách ra khỏi trái có khả năng phát triển khi nuôi cấy in-vitro trong môi trường White
(1943) với tỷ lệ nảy mầm có thể đạt 75-95% (Guzman and Rosario, 1964). 1992 Rillo và Paloma, kỹ thuật nuôi cấy phôi đã được phát triển bởi để cải tiến môi trường nuôi cấy phôi dừa sáp và đã chứng minh được rằng phôi dừa sáp phát triển tốt trong môi trường Y3 (môi trường được nghiên cứu phát triển ở Anh bởi Eeuwens năm 1976 chuyên dùng cho nuôi cấy mô cây dừa) mà khơng bổ sung chất điều hịa sinh trưởng thực vật. Areza-Ubaldo et al. (2003) đã nghiên cứu cải tiến thành cơng quy trình ni cấy phơi dừa sáp nhằm tạo ra lượng cây giống lớn phục vụ nhu cầu thương mại. Tuy nhiên, tỷ lệ cây giống/phôi được xuất vườn < 1. Philippines cũng thành công trong việc nhân giống dừa sáp bằng phương pháp nuôi cấy phôi (EMC - coconut embryo culture). Đến tháng 6/2006 tỷ lệ thành cơng trên 50% tính từ phơi ra cây con trên đồng ruộng. Tỷ lệ này cao hơn nhiều so với những kỹ thuật nuôi cấy phôi trước đây chỉ từ 10-20%.
Ở Thái Lan, năm 1987, ở tỉnh Prachuap Kirikhan đã cấy 60.000 phôi dừa sáp trên cây dừa sáp thuộc 3 nhóm dựa trên kích thước trái (trái nhỏ, trung bình và trái to). Từ những cây dừa sáp nhập từ Philippines, Thái Lan cũng đã nghiên cứu thành công kỹ thuật nuôi cấy phôi dừa sáp và đã thành công trong việc lai tạo giữa giống dừa sáp và giống dừa dứa với kết quả là trái dừa của cây lai F1 vừa sáp lại có mùi thơm đặc trưng của giống dừa dứa, rất hấp dẫn cho ngành du lịch (Romulo, 2013).
- Phương pháp nuôi cấy phôi dừa sáp trên thế giới và Việt Nam
Ở Việt Nam, một số đơn vị nghiên cứu trong nước đã nghiên cứu và áp dụng thành công kỹ thuật ni cấy phơi hữu tính tạo cây giống dừa sáp. Phương pháp ni cấy phơi hữu tính là sử dụng phơi hữu tính từ trái sáp, ni cấy in-vitro trong môi trường nhân tạo, với phương pháp này cây giống tạo ra có tỷ lệ trái sáp/quày theo lý thuyết có thể đạt 100%.
Giai đoạn 2001-2005, Viện Nghiên cứu Dầu và Cây có Dầu đã bắt đầu nghiên cứu và thành cơng bước đầu trong quy trình nhân giống dừa sáp bằng kỹ thuật ni cấy phơi hữu tính dừa sáp trong điều kiện in-vitro. Tuy nhiên, tỷ lệ thành cơng của qui trình đạt 19,2%, thời gian phát triển hồn thiện từ phơi hữu tính thành cây đủ tiêu chuẩn xuất vườn là 24 tháng (Trần Thị Ngọc Thảo, 2010).
Giai đoạn từ năm 2010-2014, Viện nghiên cứu Dầu và cây có Dầu tiếp tục nghiên cứu cải tiến qui trình cơng nghệ ni cấy phơi ở giai đoạn phịng thí nghiệm và vườn ươm góp phần tăng tỷ lệ thành cơng qui trình đạt 47,3%, thời gian phát triển hồn thiện từ phôi thành cây đủ tiêu chuẩn xuất vườn là 12-14 (Ngô Thị Kiều Dương, 2013).
Trường Đại học Trà Vinh đã tiến hành nghiên cứu nhằm hồn thiện quy trình ni cấy phôi dừa sáp và tỷ lệ thành công của quy trình này khoảng từ 45-50% (Phạm Thị Phương Thúy và ctv., 2016).
2.3.2.4 Các nguyên nhân ảnh hưởng đến kỹ thuật nhân giống dừa sáp bằng phương pháp cấy phơi
Bí mật cơng nghệ: Kết quả nhân giống dừa sáp bằng phương pháp cấy phơi tại
Philippine đạt 50% tính từ cây phơi ra cây trên đồng ruộng (Võ Văn Long, 2007). Hiện nay dừa sáp cấy phơi của Philippines đã đem lại nhiều lợi ích kinh tế cho nguời trồng dừa cũng như cung cấp các sản phẩm chế biến từ trái dừa đặc ruột cho cả thị trường nội địa và xuất khẩu đi 41 quốc gia, nhưng chỉ đáp ứng được 3% nhu cầu của thế giới và nhu cầu ngày càng gia tăng. Giống dừa trồng chủ yếu là giống dừa sáp cấy phôi và cơ sở sản xuất giống cấy phơi đã được thương mại hóa rộng khắp đất nước. Tuy nhiên, giống dừa sáp đang là tài sản quốc gia không cho phép xuất khẩu giống dừa ra ngoài lãnh thổ của Philippines.
Những vấn đề cịn tồn tại về qui trình nhân giống bằng phương pháp cấy phôi dừa sáp:
Theo Ngô Thị Kiều Dương (2013) cho thấy, nguyên nhân dẫn đến tỷ lệ thành công thấp là do:
Tỷ lệ phôi phát triển bất thường cao.
Tỷ lệ phơi phát triển thành cây hồn chỉnh trong ống nghiệm đủ tiêu chuẩn đưa ra vườn ươm thấp.
Hệ thống lá và rễ nghèo nàn (lá nhỏ, phát triển chậm, bộ rễ khơng có hoặc có ít rễ thứ cấp).
Theo Phạm Thị Phương Thúy và ctv. (2016) những nhân tố ảnh hưởng đến tỷ lệ thành cơng của quy trình được xác định gồm phơi khơng nảy mầm chiếm 15-20%, có từ 13-17% cây phơi có bộ rễ ngắn < 5cm và khơng xuất hiện các rễ phụ.
2.4 Hiện trạng sản xuất và kỹ thuật nâng cao tỷ lệ trái sáp trên dừa sáp2.4.1 Hiện trạng sản xuất