2.5.3 Diện tích trồng dừa sáp trên thế giới và Việt Nam
3.1.3 Phương pháp nghiên cứu
Theo Phạm Thị Phương Thuý và ctv. (2016) có khoảng từ 10-15% phơi nảy mầm yếu, 13-17% cây có rễ phát triển kém và tỷ lệ chết cây con từ 9-14% chính vì thế mà tỷ lệ thành cơng của quy trình đạt thấp hơn 45%, thời gian để sản xuất cho ra một cây giống trên 24 tháng. Để cải thiện quy trình nhân giống dừa sáp cấy phơi, luận án tiến hành các nghiên theo vào sơ đồ nghiên cứu như Hình 3 .16:
Giai đoạn 1
Giai đoạn 2
Giai đoạn 3
Giai đoạn 4
Hình 3.16: Sơ đồ vắn tắt quy trình ni cấy phôi dừa sáp in-vitro (Phạm Thị Phương Thúy và
ctv, 2016)
Chọn trái dừa sáp 12-12,5 tháng tuổi, tách lấy phơi có dính 1 phần cơm dừa và cấy tạo chồi
- Cồn 70% 10-15 phút, tách phôi.
- Môi trường Y3: 2 mg/l BAP, 0,2 mg/l NAA, 1 g/l than hoạt tính, 60 g/l saccharose.
- Ánh sáng: 0 lux 24 h/ngày
Cấy chuyền tạo rễ
- Môi trường Y3: 2 mg/l NAA, 0,2 mg/l BAP, 1,5 g/l than hoạt tính, 40 g/l saccharose.
- Ánh sáng: 2.000-2.500 lux, 16h/ngày
Chuyển cây ra vườn ươm, trồng vào giá thể
(giai đoạn thích nghi)
- Bầu: Túi PE 20.
- Giá thể: Trấu: Phân bò: Mụn dừa tỷ lệ 2:1:1 - Ẩm độ: 95-100%, Nhiệt độ: 27-29oC - Ánh sáng: 25-30 KLux
Cây xanh, cổ rễ láng, lá thẳng, rễ đi ra khỏi bầu
- Bầu: Chậu nhựa tròn, cao 27 cm x đường kính đáy 23 cm.
- Giá thể: Trấu: Phân bò: Mụn dừa tỷ lệ 1:1:1 - Ẩm độ: 85-90%, Nhiệt độ: 27-29oC - Ánh sáng: 35-40 KLux
Cây đủ tiêu chuẩn xuất vườn Cây có 4-5 lá, cao cây 40-50 cm
3.1.3.1 Giai đoạn nảy mầm
- Thí nghiệm 1: Thí nghiệm ảnh hưởng của tách màng bao phôi lên tỷ lệ nảy mầm của phơi dừa sáp
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí thể thức hồn tồn ngẫu nhiên gồm 5
nghiệm thức, 3 lần lặp lại với mỗi lần lặp lại là 5 phôi. - Nghiệm thức 1: Môi trường Y3 cải tiến (đối chứng)
- Nghiệm thức 2: Môi trường Y3 cải tiến + tách màng bao phôi - Nghiệm thức 3: Môi trường Y3 cải tiến + 1 mg/L Kinetin - Nghiệm thức 4: Môi trường Y3 cải tiến + 2 mg/L Kinetin - Nghiệm thức 5: Môi trường Y3 cải tiến + 3 mg/L Kinetin
Chuẩn bị mẫu thí nghiệm: mẫu thí nghiệm là các phơi đã nuôi được 6 tuần trong
môi trường Y3 cải tiến nhưng chưa nảy mầm.
Hình 3.17: Tách bỏ màng bao chồi mầm và cấy chuyền
Chuẩn bị môi trường nuôi cấy cho các nghiệm thức: Là môi trường Y3 cải tiến
(môi trường đặc) được bổ sung Kinetin với hàm lượng 1,2,3 mg/L vào môi trường tương ứng nồng độ với nghiệm thức 3, 4 và 5
Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ (%) phôi nảy mầm sau 1, 2, 3, và 4 tuần nuôi phôi dừa
sáp. Công thức tính tỷ lệ nảy mầm:
- Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của ánh sáng lên độ nảy mầm của phơi dừa sáp Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí thể thức hồn tồn ngẫu nhiên gồm 2
nghiệm thức, 3 lần lặp lại với mỗi lần lặp lại là 7 mầm.
- Nghiệm thức 1: Phôi dừa nuôi trong phịng có chiếu sáng với cường độ 2.000 – 2.500 lux.
Cách thực hiện: Phương pháp thực hiện: môi trường Y3 được bổ sung 0,2 ppm
NAA; 2 ppm BAP; 60g/l succrose, 1g/l than hoạt tính, điều chỉnh ở pH = 5,6. Mỗi ống nghiệm chứa 20 ml môi trường và mang hấp khử trùng ở nhiệt độ 1210C thời gian 20 phút. Phơi từ những trái dừa có sáp được tách khỏi trái và khử trùng bằng dung dịch cồn 70o trong thời gian 15 phút, tách lấy phôi và cấy vào môi trường và đặt vào các điều kiện nuôi sáng và tối.
Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ nảy mầm của các phôi sau 1,2, 3, 4 và 5 tuần nuôi phôi.
3.1.3.2 Giai đoạn tạo rễ
- Thí nghiệm 1: Nghiên cứu bổ sung mơi trường kích thích ra rễ, tạo lá khi cây phơi khơng ngập trong mơi trường
Bố trí thí nghiệm: Đối với các cây phơi có chiều dài rễ vượt trội, khiến cây phôi
không ngập trong môi trường và lá không phát triển, các cây phôi sẽ được bổ sung thêm môi trường Y3 dạng lỏng với các nồng độ NAA khác nhau. Thí nghiệm được bố trí thể thức hồn tồn ngẫu nhiên gồm 4 nghiệm thức, 5 lần lặp lại với mỗi lần lặp lại là 4 mầm.
- Nghiệm thức 1: Không bổ sung môi trường (Đối chứng)
- Nghiệm thức 2: Môi trường Y3 bổ sung 0,2 ppm BAP + 2 ppm NAA
- Nghiệm thức 3: Môi trường Y3 bổ sung 0,2 ppm BAP + 3 ppm NAA
- Nghiệm thức 4: Môi trường Y3 bổ sung 0,2 ppm BAP + 4 ppm NAA
- Nghiệm thức 5: Môi trường Y3 bổ sung 0,2 ppm BAP + 5 ppm NAA
Cách thực hiện: Chuẩn bị mẫu thí nghiệm: mẫu thí nghiệm là các cây phơi có
chiều dài rễ vượt trội, khiến cây phơi không ngập trong môi trường và lá không phát triển.
Mơi trường thí nghiệm: Mơi trường Y3 được bổ sung các nồng độ NAA; 0,2
ppm BAP; 40g/l đường succrose, 5g/l agar, 1g/l than hoạt tính, điều chỉnh ở pH = 5,6. Mơi trường được cho vào các chai và mang hấp khử trùng ở nhiệt độ 1210C thời gian
20 phút. Sau khi hấp xong, để cho giảm nhiệt độ xuống và được bổ sung vào các chai thí nghiệm.
Chỉ tiêu theo dõi: Chiều dài rễ chính (cm); số lượng rễ thứ cấp; số lá chiều dài
thân (cm).
- Thí nghiệm 2: nghiên cứu kích thích ra rễ đối với các cây phơi sau 4 tháng nhưng chiều dài rễ < 5 cm
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí thể thức hồn tồn ngẫu nhiên gồm 6
nghiệm thức, 3 lần lặp lại với mỗi lần lặp lại là 5 mầm sau 4 tháng tuổi vô mẫu nhưng rễ mầm phát triển < 5cm. Nghiệm thức 1: Môi trường Y3 cải tiến + 2 ppm NAA (đối chứng)
- Nghiệm thức 2: Môi trường Y3 cải tiến + 1 ppm IAA
- Nghiệm thức 3: Môi trường Y3 cải tiến + 2 ppm IAA
- Nghiệm thức 4: Môi trường Y3 cải tiến + 3 ppm IAA
- Nghiệm thức 5: Môi trường Y3 cải tiến + 4 ppm IAA
- Nghiệm thức 6: Môi trường Y3 cải tiến + 5 ppm IAA
Cách thực hiện: Đối với các cây phơi có rễ cái dài < 5 cm và chưa thấy rễ bên
xuất hiện thì được cấy truyền vào mơi trường bố trí thí nghiệm.
Chỉ tiêu theo dõi: 7, 14, 21, 28 ngày sau khi bố trí thí nghiệm: chiều dài rễ
chính.
- Thí nghiệm 3: Nghiên cứu cắt rễ để kích thích ra rễ, lá đối với các cây phôi không ngập trong môi trường
phôi không ngập trong môi trường và lá không phát triển, cây được lấy ra khỏi chai cắt rễ và cấy vào mơi trường thí nghiệm.Thí nghiệm được bố trí thể thức hồn tồn ngẫu nhiên gồm 4 nghiệm thức, 5 lần lặp lại với mỗi lần lặp lại là 4 mầm.
- Nghiệm thức 1: Không cắt rễ (Đối chứng)
- Nghiệm thức 2: Cắt rễ + môi trường Y3 bổ sung 0,2 ppm BAP + 2 ppm NAA
- Nghiệm thức 3: Cắt rễ + môi trường Y3 bổ sung 0,2 ppm BAP + 3 ppm NAA
- Nghiệm thức 4: Cắt rễ + môi trường Y3 bổ sung 0,2 ppm BAP + 4 ppm NAA
- Nghiệm thức 5: Cắt rễ + môi trường Y3 bổ sung 0,2 ppm BAP + 5 ppm NAA
Cách thực hiện: Chuẩn bị mẫu thí nghiệm: mẫu thí nghiệm là các cây phơi có
chiều dài rễ vượt trội, khiến cây phôi không ngập trong mơi trường và lá khơng phát triển.
Mơi trường thí nghiệm: Môi trường Y3 được bổ sung các nồng độ NAA; 0,2
ppm BAP; 40g/l đường succrose, 5g/l agar, 1g/l than hoạt tính, điều chỉnh ở pH = 5,6. Mơi trường được cho vào các chai và mang hấp khử trùng ở nhiệt độ 1210C thời gian 20 phút.
Chỉ tiêu theo dõi: Chiều dài rễ chính (cm); số lượng rễ thứ cấp; số lá chiều dài
thân (cm).
3.1.3.3 Giai ra cây con ngoài vườm ươm
- Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của ẩm đợ lên sinh trưởng của cây phôi giai đoạn thuần dưỡng
Bố trí thí nghiệm: Đây là thí nghiệm 1 nhân tố với 4 nghiệm thức, 10 lần lặp lại
(mỗi lần lặp lại 1 cây) ở các mức ẩm độ khác nhau: 50%; 70%; 90% và 100%
Cách thực hiện: Mẫu: Là những cây có 2-4 lá thật, lá bẹ cứng, màu xanh đậm,
cây ra ngơi khoảng 1 tháng.
Quy trình chuyển cây trong óng nghiệm qua giai đoạn th̀n dưỡng ở mơi trường tự nhiên: Cây dừa sáp sau khi lấy ra khỏi môi trường nhân tạo giữ ẩm 24 giờ,
bằng cách dùng lưới đen che lại và sử dụng chụp bạt cao su lại để duy trì ẩm độ ổn định theo yêu cầu của nghiên cứu, tưới nước 2 lần/ngày.
Chế đợ chăm sóc cây: Trong thời gian thí nghiệm hằng ngày tiến hành tưới phun
bằng nước sạch 2 lần/ngày.
Chỉ tiêu theo dõi: Số lá, chiều cao cây, tỷ lệ sống sau 1, 2, 3, 4 tháng
- Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của ẩm độ lên sinh trưởng của cây phôi giai đoạn cây con
Bố trí thí nghiệm: Đây là thí nghiệm 1 nhân tố với 4 nghiệm thức, 10 lần lặp lại
(mỗi lần lặp lại 1 cây) ở các mức ẩm độ khác nhau: 85%; 90%; 95%; và 100%
Cách tiến hành: Chọn mẫu: Là những cây có 3-4 lá thật lá bẹ cứng, màu xanh
đậm, có 2-3 rễ thứ cấp trung bình 3-4 tháng từ giai đoạn ra rễ đến ra vườn ươm.
Quy trình chuyển cây trong điều kiện thuần dưỡng sang giai đoạn cây con:
Cây giai đoạn thuần dưỡng được 1 tháng và bắt đầu ra rễ mới sẽ chuyển sang bầu lớn hơn và sử dụng những cây này để bố trí thí nghiệm.
Chế đợ chăm sóc cây: trong thời gian thí nghiệm hằng ngày tiến hành tưới phun
bằng nước sạch 2 lần/ngày.
Chỉ tiêu theo dõi: Số lá, chiều cao cây, tỷ lệ sống sau 1, 2, 3, và 4 tháng
- Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của cường đợ ánh sáng lên sinh trưởng của cây
phơi giai đoạn cây con
Bố trí thí nghiệm: Đây là thí nghiệm 1 nhân tố (lưới che) với 4 nghiệm thức, 10
lần lặp lại (mỗi lần lặp lại 1 cây). - Không dùng lưới che
- Lưới trắng độ che nắng 20% - Lưới đen độ che nắng 50% - Lưới xanh độ che nắng 70%
Cách tiến hành: Đối tượng nghiên cứu là những cây phơi dừa sáp có 2-4 lá thật,
lá bẹ cứng, màu xanh đậm, cây ra ngôi khoảng 1 tháng.
Cây sau thi ra ngôi và giữ ẩm 1 tháng, tiến hành chuyển cây qua bầu lớn có đường kính đáy 23 cm, chiều cao chậu là 27 cm. Đặt cây ở các khu vực khác nhau trong nhà lưới có điều kiện ánh sáng và nhiệt độ như nhau, sau đó dùng các loại lưới che màu đen, màu xanh, màu trắng để giảm cường độ chiếu sáng (Hình 5 .45).
Chế đợ chăm sóc cây: trong thời gian thí nghiệm hằng ngày tiến hành tưới phun
bằng nước sạch 2 lần/ngày (mỗi lần phun từ 3-5 phút cho đến khi ướt đều mặt lá).
Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của loại giá thể và tỉ lệ phối trộn lên sinh trưởng của cây
phơi giai đoạn cây con.
Mục đích: Tìm được giá thể thích hợp lên sinh trưởng và phát triển của cây phôi giai
đoạn cây con.
Mẫu: là những cây ở giai đoạn ra ngôi được khoảng hơn 1 tháng cây tốt khỏe có từ 2-3
lá, cây bắt đầu ra rễ mới.
Phương pháp thực hiện: cây con sau khi ra ngôi được hơn 1 tháng cây bắt đầu ra rễ
mới tiến hành chuyển cây qua chậu lớn có đường kính đáy 23 cm, chiều cao chậu là 27 cm, sau đó để trong nhà lưới dưới lưới xanh độ che nắng 70%.
Phương pháp bố trí thí nghiệm
Đây là thí nghiệm 1 nhân tố (giá thể) với nghiệm thức, 10 lần lặp lại (mỗi lần lặp lại 1 cây).
Tổng đơn vị thí nghiệm là 3 x 10 = 30.
- Nghiệm thức 1: 1 phân bò: 1 xơ dừa
- Nghiệm thức 2: 2 phân bò: 1 xơ dừa
- Nghiệm thức 3: 1 phân bò: 2 xơ dừa
Thời gian lấy chỉ tiêu: 1, 2, 3, 4 tháng sau khi bố trí thí nghiệm. Chỉ tiêu theo dõi: cao cây và số lá trên cây.
3.1.4 Xử lý số liệu
Số liệu được tính tốn xử lý bằng các cơng thức tốn học thơng thường sử phần mềm Microsoft ofice Excel 2010 và IBM SPSS Statistics 20. Kiểm định độ khác biệt bằng phép thử Duncan, t–Test ở ở hai mức ý nghĩa 1% và 5%.