Chương 4 BÀN LUẬN
4.2.1. Về biến đổi thành phần nucleotide và amino acid gen PB
* Về số lượng nucleotide và amino acid:
Kết quả so sỏnh trỡnh tự gen PB2 của 6 biến chủng virus cỳm A/H5N1 nghiờn cứu, với trỡnh tự gen tương ứng của 19 chủng đại diện trong 4 nhúm virus lựa chọn so sỏnh, phõn lập trờn nhiều loài vật chủ từ 2003 – 2012, cho thấy:
- Sỏu biến chủng virus virus cỳm A/H5N1 nghiờn cứu cú sự bảo tồn về độ dài gen PB2, chứa 2.280 nucleotide mó húa cho 759 amino acid, khụng cú đột biến thay đổi về số lượng (thờm vào hay xúa đi 01 hoặc nhiều nucleotide) hoặc xuất hiện cỏc bộ mó kết thỳc (“STOP” codon), so với trỡnh tự gen tương ứng của 19 chủng đại diện trong 4 nhúm virus lựa chọn so sỏnh.
- Kết quả trờn cũng phự hợp với cỏc nghiờn cứu về đột biến ở gen PB2 của virus cỳm A/H5N1, phõn lập trờn nhiều loài vật chủ giai đoạn sau bựng phỏt dịch cỳm gia cầm A/H5N1 năm 2003, tại Việt Nam và trờn thế giới đến nay [12], [70], [76], [77], [78], [80].
* Về biến đổi thành phần nucleotide và amino acid:
+ Kết quả so sỏnh cho thấy, cú sự biến đổi mạnh mẽ về thành phần nucleotide gen PB2 (110 vị trớ sai khỏc, tỉ lệ tương đồng đạt 92% - 99%), nhưng lại cú sự bảo tồn cao về thành phần amino acid ở protein PB2 suy diễn (chỉ cú 19 vị trớ thay đổi, tỉ lệ tương đồng đạt 96% - 100%), giữa 6 biến chủng virus cỳm A/H5N1 nghiờn cứu
và 19 chủng đại diện, mang tớnh chất tương đối tập trung theo 4 nhúm virus clade 1, 1.1, 2.3.4.3 và 2.3.2.1 lựa chọn so sỏnh.
Cỏc vị trớ sai khỏc nucleotide là do đột biến thay thế xảy ra trong trỡnh tự gen PB2, qua quỏ trỡnh virus cỳm A/H5N1 lưu hành gõy bệnh ở cỏc loài vật chủ. Cỏc đột biến trong trỡnh tự gen PB2 xảy ra tương đối tập trung theo 4 nhúm virus clade 1, 1.1, 2.3.4.3 và 2.3.2.1 so sỏnh cho thấy, gen PB2 cú sự biến đổi hỡnh thành cỏc phõn nhúm gen tương ứng với cỏc clade gen H5 kể trờn của virus cỳm A/H5N1.
Sự bảo tồn về thành phần amino acid trong trỡnh tự protein PB2 là do:
- Cỏc nucleotide cú vị trớ và vai trũ khỏc nhau trong bộ ba mó húa amino acid, dẫn đến cú sự thay đổi về nucleotide mà khụng làm thay đổi amino acid được mó húa tương ứng [8], [106], [107].
- Mặt khỏc, gen PB2 mó húa cho protein PB2 polymerase, một đơn vị cấu tạo và chức năng trong phức hợp enzym polymerase của virus cỳm A/H5N1. Vỡ vậy, sự bảo tồn thành phần amino acid giỳp ổn định cấu trỳc và hoạt tớnh protein PB2 cũng như phức hợp enzym polymerase, liờn quan đến khả năng nhõn lờn của virus cỳm A/H5N1 trong tế bào cảm thụ ở cỏc loài vật chủ [1], [2], [6], [12], [70].
+ Kết quả phõn tớch cỏc vị trớ đột biến thay thế nucleotide trong trỡnh tự gen PB2 dẫn đến thay đổi amino acid trong trỡnh tự protein PB2 suy diễn, của 6 biến chủng virus cỳm A/H5N1 nghiờn cứu, với trỡnh tự gen tương ứng của 19 chủng đại diện trong 4 nhúm virus lựa chọn so sỏnh, cho thấy:
- Trỡnh tự gen PB2 của 6 biến chủng virus cỳm A/H5N1 nghiờn cứu, gồm: DkQT801-2011, DkQT802-2011, DkNA72-2007, DkNA114-2007, CkDT382-2008 và DkTG926-2009, lần lượt cú sự đồng nhất cao về thành phần nucleotide và amino acid, tỉ lệ tương đồng đạt 96% – 99% và 98% – 100% theo thứ tự, so với trỡnh tự gen PB2 của cỏc chủng đại diện trong 3 nhúm virus clade 2.3.2.1, 2.3.4.3 và 1.1 tương ứng. Trỡnh tự gen PB2 cũng cú sự đồng nhất cao về thành phần nucleotide và amino acid, tỉ lệ tương đồng đạt 98% – 99% và 98% – 100%, giữa cỏc chủng virus cỳm A/H5N1 phõn lập tại Việt Nam so với trỡnh tự tương ứng của cỏc chủng phõn lập tại Thỏi Lan trong nhúm virus clade 1. Kết quả này chứng tỏ gen PB2 của 6 biến chủng virus cỳm A/H5N1 nghiờn cứu, cũng như cỏc chủng virus phõn lập tại Việt Nam cỏc năm 2003 – 2012, cú ớt biến đổi và cú thể cú chung nguồn gốc so với gen
PB2 của cỏc chủng trong 4 nhúm virus clade 1, 1.1, 2.3.4.3 và 2.3.2.1 tương ứng, phõn lập tại cỏc quốc gia lõn cận (Trung Quốc, Lào, Campuchia và Thỏi Lan).
- Bờn cạnh đú, kết quả phõn tớch cũng cho thấy, trỡnh tự gen PB2 của 25 chủng virus cỳm A/H5N1 so sỏnh, cú sự khỏc nhau ở một số vị trớ nucleotide dẫn đến thay đổi về amino acid, tương ứng theo 4 nhúm virus clade 1, 1.1, 2.3.4.3 và 2.3.2.1. Tỉ lệ tương đồng thành phần nucleotide và amino acid trỡnh tự gen PB2, của cỏc chủng giữa 4 nhúm virus kể trờn so sỏnh theo từng đụi một thay đổi theo thứ tự, từ 92% – 94% và 96% – 97% cho đến 96% – 97% và 97% – 98%.
- Hơn nữa, trỡnh tự gen PB2 của cỏc chủng trong 2 nhúm virus clade 2.3.2.1 và 2.3.4.3, cú sự sai khỏc về 6/18 vị trớ nucleotide dẫn đến thay đổi amino acid, tỉ lệ tương đồng chỉ đạt là 92% – 96% và 96% – 98% theo thứ tự, so với trỡnh tự tương ứng của cỏc chủng trong 2 nhúm virus clade 1 và 1.1.
Cỏc kết quả phõn tớch ở trờn gúp phần chứng tỏ rằng, gen PB2 cú sự biến đổi chia tỏch thành 4 phõn nhúm gen thuộc 2 nhúm gen, tương ứng với 4 clade 2.3.2.1, 2.3.4.3, 1, 1.1 thuộc 2 nhúm gen H5 clade 2 và clade 1, trong hệ gen của virus cỳm A/H5N1 phõn lập tại Việt Nam và một số quốc gia trờn thế giới từ 2003 đến nay. Kết quả phõn tớch cũng cho thấy, gen PB2 của nhúm virus clade 2.3.2.1 lưu hành trong cỏc năm 2009 – 2012, cú thể cú chung nguồn gốc với gen tương ứng của nhúm virus clade 2.3.4.3 lưu hành giai đoạn 2007 – 2008. Trong khi, gen PB2 của nhúm virus clade 1.1 lưu hành trong cỏc năm 2007 – 2012, cú thể cú chung nguồn gốc với gen tương ứng của nhúm virus clade 1 lưu hành giai đoạn 2003 – 2005.
- Mặt khỏc, 18 vị trớ thay đổi về amino acid được phõn bố ở cả vựng C-tận và N-tận, tương ứng với cỏc vựng cấu trỳc liờn kết với protein PB1 và biểu hiện hoạt tớnh enzym trờn trỡnh tự protein PB2, của cỏc chủng trong 4 nhúm virus clade 2.3.2.1, 2.3.4.3, 1 và 1.1. Cỏc vị trớ thay đổi amino acid đều khụng đỳng là cỏc vị trớ amino acid, được chứng minh ảnh hưởng đến thay đổi cấu trỳc và hoạt tớnh của protein PB2 polymerase, theo hướng liờn quan đến thay đổi độc lực và khả năng thớch nghi nhõn lờn của virus cỳm A/H5N1 ở tế bào cảm thụ của người và động vật cú vỳ. Tuy nhiờn, cỏc vị trớ thay đổi amino acid này cũng cú thể ảnh hưởng đến khả năng liờn kết với protein PB1, hoạt tớnh và khả năng tương tỏc với cỏc dạng cấu trỳc
tớn hiệu định vị nhõn (importin-α) trờn màng nhõn tế bào cảm thụ, của protein PB2 polymerase ở cỏc chủng trong 4 nhúm virus núi trờn.
+ Sự thay đổi amino acid E627K trong protein PB2 liờn quan đến thay đổi khả năng thớch nghi nhõn lờn, của virus cỳm A ở nhiệt độ cơ thể giữa gia cầm và người. Đõy là một trong những yếu tố biến đổi di truyền cú vai trũ quan trọng, gúp phần giỳp virus cỳm A vượt qua rào cản loài, chuyển nhiễm và thớch nghi lõy truyền từ gia cầm sang người, được phỏt hiện ở 3 phõn type virus cỳm A/H1N1, A/H2N2 và A/H3N1, nguyờn nhõn gõy ra cỏc đại dịch cỳm A ở người trước đõy [40] [45], [52], [55], [91]. Đột biến này cũng đó được chứng minh làm gia tăng khả năng nhõn lờn của virus cỳm A/H5N1, trong cỏc mụ hỡnh thực nghiệm ở chuột và tế bào của động vật cú vỳ [22], [51], [56], [57], [58], [96], [99]. Phõn tớch amino acid tại vị trớ 627 của protein PB2, giữa 25 chủng trong 4 nhúm virus lựa chọn so sỏnh cho thấy, cú sự bảo tồn gluctamic acid tại vị trớ 627 (E627) trong protein PB2, của 06 biến chủng virus cỳm A/H5N1 nghiờn cứu cựng với cỏc chủng phõn lập từ người và gia cầm trong 2 nhúm virus clade 2.3.2.1 và 1.1. Đặc biệt, đó cú sự thay đổi từ glutamic acid thành lysin tại vị trớ 627 (E627K) trong protein PB2, của 3 chủng virus clade 2.3.4.3 và 4 chủng virus clade 1, phõn lập từ người bệnh tại Việt Nam và Thỏi Lan cỏc năm 2003 – 2007. Kết quả trờn phự hợp với cỏc kết quả giỏm sỏt đột biến thay đổi amino acid tại vị trớ 627 trong protein PB2, của 4 nhúm virus clade 1, 1.1, 2.3.4.3, 2.3.2.1 lưu hành tại Việt Nam và trờn thế giới, đó cụng bố trước đõy của cỏc tỏc giả: Lờ Quỳnh Mai (2011) [80], Cao Thị Bảo Võn và cs. (2005) [104], Chen và cs. (2004, 2006) [66], [67], Nguyen T và cs. (2012) [77], Nguyen TD và cs. (2008) [78], Wan
và cs. (2008) [76].
- Bờn cạnh đú, kết quả này cho thấy gen PB2 của một số chủng trong 2 nhúm virus clade 1 và 2.3.4.3, đó cú sự biến đổi liờn quan đến thớch ứng nhõn lờn của virus ở nhiệt độ cơ thể người. Tuy nhiờn, tỉ lệ tương đồng cao về thành phần nucleotide và amino acid gen PB2, giữa cỏc chủng virus phõn lập từ người bệnh so với cỏc chủng phõn lập từ gia cầm bệnh trong 4 nhúm virus clade 1, 1.1, 2.3.4.3 và 2.3.2.1, chứng tỏ cỏc chủng virus gõy bệnh trờn người là do xõm nhiễm trực tiếp từ gia cầm bệnh. Điều này cũng phự hợp với kết quả nghiờn cứu phõn tớch gen H5 đó
được cụng bố, liờn quan đến khả năng thớch nghi xõm nhiễm tế bào cảm thụ của người ở cỏc chủng trong 4 nhúm virus kể trờn [4], [76], [77], [78], [80], [81], [86].
4.2.2. Về biến đổi thành phần nucleotide và amino acid gen PB1