17 M13R 5’-CAGGAAACAGCATTGAC-3’ Mồi giải trỡnh tự
2.2.6.Kỹ thuật dũng húa DNA
* Mục đớch: Thu nhận một số lượng lớn bản sao đoạn/phõn đoạn DNA sản phẩm PCR/RT-PCR một cỏch chớnh xỏc làm nguyờn liệu cho giải trỡnh trỡnh tự.
* Nguyờn lớ: Dũng húa (cloning) DNA là ghộp-nối (ligation) một đoạn/phõn đoạn DNA ngoại lai (sản phẩm PCR/RT-PCR), trong một vũng DNA được thiết kế sẵn, gọi là plasmid mang (vector dẫn truyền), tạo ra vector tỏi tổ hợp và chuyển nạp (transformation) vào tế bào chủ thớch ứng (thường sử dụng là tế bào vi khuẩn
Escherichia coli thuần chủng, E. coli) tạo dũng tế bào tỏi tổ hợp [8], [106], [107].
* Kỹ thuật: Trong nghiờn cứu thực hiện dũng húa, lưu giữ DNA cỏc gen PB2, PB1 và PA của 6 biến chủng virus cỳm A/H5N1 trong plasmid tỏi tổ hợp, bằng bộ kit tỏch dũng TA cloningđ Kit (Invitrogen, Nhật Bản). Sau đú, thu nhận DNA plasmid tỏi tổ hợp bằng bộ kit AccuPrepđ Plasmid mini Extraction Kit (Bioneer, Hàn Quốc). Kiểm tra DNA plasmid tỏi tổ hợp cần thu nhận bằng phản ứng cắt sử dụng enzym giới hạn (restriction enzym) EcoRI. Gồm cỏc bước cụ thể như sau:
+ Ghộp-nối đoạn DNA sản phẩm PCR vào plasmid mang
- Plasmid mang sử dụng để “ghộp-nối” cỏc đoạn DNA, sản phẩm của phản ứng PCR/RT-PCR, thường sử dụng là vector pCR2.1 hoặc pCR2.1đ-TOPOđ, được cung cấp theo bộ kit TA cloningđ Kit của hóng Invitrogen (Nhật Bản). Đõy là loại vector thiết kế cú đầu lồi thymin (T) phự hợp gắn với cỏc đoạn DNA đó được gắn thờm adenin (A) ở đầu 3’-, sản phẩm của phản ứng PCR sử dụng enzym Taq–DNA polymerase, theo nguyờn tắc bổ sung nhờ enzym nối T4–DNA ligase hoặc enzym topoisomerase tạo nờn plasmid tỏi tổ hợp chứa đoạn DNA ngoại lai (Hỡnh 2.4).
Hỡnh 2.4. Sơ đồ cấu trỳc của vector pCRđ2.1TOPO (Invitrogen)
Ghi chỳ: PCR product: vị trớ “ghộp–nối” đoạn DNA ngoại lai trong plasmid; T7 promotor: vị trớ gen khởi động T7; M13 Forward (-20) primer: vị trớ bỏm mồi giải trỡnh tự M13F; M13 Reverse primer: vị trớ bỏm mồi giải trỡnh tự M13R).
- Vị trớ để “ghộp-nối” đoạn DNA ngoại lai, sản phẩm PCR, nằm trong trỡnh tự gen lacZ, gen này mó húa tổng hợp enzym β-galactosidase xỳc tỏc thủy phõn X-gal
tạo ra cỏc dẫn chất cú màu xanh, khi chuyển nạp plasmid vào vi khuẩn E. coli và nuụi cấy trong mụi trường cú chứa X-gal. Cỏc vi khuẩn mang plasmid khụng chứa đoạn DNA ngoại lai tỏi tổ hợp, gen lacZ sẽ tổng hợp protein cú hoạt tớnh enzym β- galactosidase, phõn hủy X-gal tạo nờn khuẩn lạc màu xanh. Trỏi lại, khi đoạn DNA ngoại lai được gắn vào vị trớ “ghộp-nối” trong gen lacZ, làm cho gen này khụng hoạt động hoặc mó húa tổng hợp protein khụng cú hoạt tớnh enzym β-galactosidase,
X-gal trong mụi trường nuụi cấy khụng bị phõn hủy và khuẩn lạc của cỏc vi khuẩn mang plasmid tỏi tổ hợp sẽ cú màu trắng.
- Thành phần phản ứng “ghộp-nối” đoạn DNA sản phẩm PCR, vào plasmid pCRđ2.1-TOPOđ được trỡnh bày ở bảng 2.10.
Bảng 2.10. Thành phần phản ứng ghộp - nối đoạn DNA sản phẩm PCR vào plasmid pCRđ2.1-TOPOđ
Tờn húa chất Thể tớch (àl)
10X Ligation Buffer 1
Vector pCRđ2.1-TOPOđ (25ng/μl) 1
Enzym T4-ligase(5U/àl) 1
Nước tinh khiết (khử ion) 4
DNA sản phẩm PCR (50ng/μl) 3
Tổng thể tớch: 10
- Hỗn hợp phản ứng được ủ ở nhiệt độ 140C trong vũng ớt nhất 6 - 8 giờ. Sau đú chuyển nạp vào tế bào khả biến DH5α-T1 và nuụi cấy trờn đĩa Petri chứa mụi trường thạch LB (Luria-Bertani agar) 1,5 % cú chứa khỏng sinh và X-gal.
Tế bào sử dụng để chuyển nạp là tế bào khả biến (competent cells) E.coli
chủng DH5α-T1 hoặc chủng Top10, được cung cấp theo bộ kit TA cloningđ Kit (Invitrogen, Nhật Bản). Hệ gen của chủng DH5α-T1 đó được loại bỏ gen mó húa enzym nuclease, do đú trỏnh được hiện tượng phõn cắt cỏc đoạn DNA ngoại lai. Mặt khỏc, lớp thành tế bào cũng được biến đổi nhằm tăng khả năng tiếp nhận cỏc DNA plasmid ngoại lai trong quỏ trỡnh chuyển nạp, hệ enzym trong tế bào E.coli
chủng DH5α - T1 phự hợp với vector tỏch dũng pCRđ2.1-TOPOđ, giỳp gia tăng khả năng nhõn lờn của plasmid tỏi tổ hợp ở trong tế bào. Khi được chuyển nạp vào tế bào, plasmid tỏi tổ hợp sẽ cựng nhõn lờn và phõn chia cựng với hệ gen tế bào chủ khi tế bào phõn chia trong mụi trường nuụi cấy.
Chọn lọc và nuụi cấy cỏc dũng vi khuẩn (khuẩn lạc, clone) được thực hiện theo cỏc bước trỡnh bày trong phụ lục 5 (xem phụ lục 5).
+ Tỏch chiết DNA plasmid tỏi tổ hợp từ dũng vi khuẩn nuụi cấy:
Chỳng tụi sử dụng bộ kit AccuPrepđ Plasmid mini Extraction Kit (Bioneer, Hàn Quốc), để tỏch chiết DNA plasmid tỏi tổ hợp từ cỏc dũng vi khuẩn sau chuyển nạp.
- Qui trỡnh tỏch chiết DNA plasmid tỏi tổ hợp được thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất (xem phụ lục 6).
- Kiểm tra DNA plasmid tỏi tổ hợp bằng phản ứng cắt sử dụng enzym EcoRI: Do vector pCRđ2.1TOPOđ được thiết kế cú điểm cắt của enzym giới hạn EcoRI (trỡnh tự nucleotide nhận biết điểm cắt là -GGGTTC-) tại hai đầu của vựng tiếp nhận DNA ngoại lai, nờn khi được cắt bằng EcoRI, phõn tử DNA plasmid tỏi tổ hợp được cắt thành hai đoạn hoặc 3 đoạn (trỡnh tự đoạn DNA ngoại lai cú chứa điểm cắt của EcoRI). Trong đú, một đoạn DNA cú độ dài 3,9 kb của vector pCRđ2.1TOPOđ, và 1 hoặc 2 đoạn cú tổng độ dài tương ứng với độ dài đoạn DNA sản phẩm PCR được gài vào vựng nhõn dũng của vector. Thành phần phản ứng cắt DNA plasmid tỏi tổ hợp bằng enzym EcoRI được trỡnh bày trong bảng 2.11.
Bảng 2.11. Thành phần phản ứng cắt DNA plasmid tỏi tổ hợp bằng EcoRI
Tờn húa chất Thể tớch (àl) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Buffer cho EcoRI 2
DNA plasmid tỏi tổ hợp 1
Nước tinh khiết 16
Tổng thể tớch: 20
Sản phẩm DNA plasmid tỏi tổ hợp sau phản ứng cắt bằng EcoRI được điện di kiểm tra trờn thạch agarose 1 %.