Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIấN CỨU
2.2.2.Thiết kế cỏc trỡnh tự mồi nucleotide sử dụng trong nghiờn cứu
+ Thiết kế mồi chuyển cDNA hệ gen của virus cỳm A/H5N1: Mỗi phõn đoạn gen RNA hệ gen của virus cỳm A/H5N1 cú chứa một đoạn trỡnh tự dài 12 – 15 nucleotide cú tớnh bảo tồn cao tại đầu 3’- và 5’-. Trỡnh tự này chứa cỏc nucleotide bổ xung với nhau tạo ra vựng tận cựng 3’- và 5’- của cấu trỳc xoắn α ở mỗi phõn đoạn [1], [2]. Dựa trờn đặc tớnh này nhiều nhúm nghiờn cứu đó thiết kế mồi chuyển cDNA, thu nhận thành cụng đầy đủ độ dài cỏc phõn đoạn RNA hệ gen của virus cỳm A [108], [109], [110].
Đối với virus cỳm A/H5N1 đang lưu hành từ 2003 – 2012, cú sự biến đổi mạnh mẽ trong hệ gen, đặc biệt là sự tỏi tổ hợp 6 phõn đoạn gen khung bao gồm cỏc gen PB2, PB1 và PA [4], [66], [76], [77], [78], [82], [88]. Vỡ vậy, cỏc mồi thiết kế và sử dụng chuyển cDNA hệ gen virus cỳm A/H5N1 trong nghiờn cứu (Bảng 2.4), gồm:
- Mồi 468F cú độ dài 12 nucleotide sử dụng để gia tăng hiệu quả thu nhận cDNA hệ gen của virus cỳm A/H5N1, làm nguyờn liệu cho phản ứng PCR thu nhận cỏc gen: PB2; PB1 và PA, được thiết kế dựa trờn trỡnh tự 12 – 15 nucleotide bảo tồn đầu 3’- và 5’- của cỏc phõn đoạn gen này lưu trữ trong Ngõn hàng gen.
- Bờn cạnh đú, mồi random hexamer cung cấp theo bộ kit chuyển đổi cDNA của hóng Fementas (Bảng 2.4) cũng được sử dụng trong quỏ trỡnh chuyển cDNA, để lợi dụng tớnh chất bỏm xỏc xuất của mồi này và gia tăng hiệu suất tổng hợp thành cụng cDNA hệ gen virus cỳm A/H5N1. Mồi random hexamer là hỗn hợp cỏc đoạn oligonucleotide gồm 6 nucleotide bất kỡ sợi đơn, cú khả năng bỏm xỏc suất đối xứng bổ sung kế tiếp nhau vào sợi RNA với tần suất cao, để tổng hợp chuỗi nucleotide tạo nờn hai sợi DNA là sản phẩm cDNA của toàn bộ hệ gen.
Bảng 2.4. Danh sỏch mồi chuyển cDNA, kiểm tra cDNA hệ gen, thu nhận và giải trỡnh tự cỏc gen PB2, PB1 và PA của virus cỳm A/H5N1 trong nghiờn cứu
Số
TT Tờn mồi Trỡnh tự mồi (5’ 3’) Mụ tả
Sản phẩm
PCR
1 468F 5’-AGCAAAAGCAGG-3’ Mồi chuyển cDNA cDNA
2 Random Hexamer 5’-NpNpNpNpsNpsN-3’ Mồi chuyển cDNA cDNA3 H5F1 5’-ACATACTGGAAAGGACACACAACG-3’ Kiểm tra cDNA Gen H5 3 H5F1 5’-ACATACTGGAAAGGACACACAACG-3’ Kiểm tra cDNA Gen H5
~ 1kb 4 H5R1 5’-GGCATACTAGAGTTTATCGCCC-3’ Kiểm tra cDNA