Chương 3 KẾT QUẢ NGHIấN CỨU
3.1.2. Kết quả PCR thu nhận và dũng húa DNA cỏc gen PB2, PB1 và PA
* Kết quả PCR thu nhận DNA cỏc gen PB2, PB1 và PA
Kết quả điện di kiểm tra DNA cỏc gen PB2, PB1 và PA, thu nhận từ PCR với cỏc cặp mồi đặc hiệu và cDNA hệ gen của 6 biến chủng virus cỳm A/H5N1 trong nghiờn cứu, được trỡnh bày ở cỏc hỡnh 3.2 (gen PB2), hỡnh 3.3 (gen PB1) và hỡnh 3.4 (gen PA).
+ Kết quả kiểm tra DNA gen PB2 thu nhận sau PCR:
Kết quả ở hỡnh 3.2 cho thấy, 4 mẫu DNA gen PB2 thu nhận sau PCR của cỏc biến chủng virus DkNA72-2007, DkNA114-2007, CkDT382-2008 và DkTG926-2009 (Hỡnh 3.2A), cựng với 2 mẫu của cỏc biến chủng virus DkQT801-2011 và DkQT802-2011 (Hỡnh 3.2B) theo thứ tự, đều cho 1 băng sỏng biểu hiện sản phẩm DNA trờn hỡnh điện di. Cỏc sản phẩm DNA núi trờn đều cú độ dài khoảng 2,3 kb khi đối chiếu với marker λ HindIII, tương ứng độ dài DNA gen PB2 dự kiến với cặp mồi KPB2F – KPB2R (Hỡnh 3.2).
Hỡnh 3.2. Kết quả điện di kiểm tra DNA gen PB2 của 6 biến chủng virus cỳm A/H5N1 nghiờn cứu thu nhận sau PCR
Ghi chỳ: (A): DNA gen PB2 của 4 biến chủng virus DkNA72-2007, DkNA114-2007, CkDT382-2008 và
DkTG926-2009, (M: Marker λ HindIII; 1: DkNA72-2007; 2: DkNA114-2007; 3: CkDT382-2008; 4:
DkTG926-2009). (B): DNA gen PB2 của 2 biến chủng virus DkQT801-2011 và DkQT802-2011, (1:
DkQT801-2011 và 2: DkQT802-2011).
+ Kết quả kiểm tra DNA gen PB1 thu nhận sau PCR:
- Kết quả ở hỡnh 3.3A cho thấy, 4 mẫu kiểm tra DNA gen PB1 thu nhận sau PCR của 4 biến chủng virus DkNA72-2007, DkNA114-2007, CkDT382-2008 và
DkTG926-2009 theo thứ tự, đều cú 1 băng sỏng biểu hiện sản phẩm DNA độ dài khoảng 2,3 kb, tương ứng độ dài gen PB1 dự kiến (Hỡnh 3.3A).
Hỡnh 3.3. Kết quả điện di kiểm tra DNA gen PB1 của 6 biến chủng virus cỳm A/H5N1 nghiờn cứu thu nhận sau PCR
Ghi chỳ: (A): DNA gen PB1 của 4 biến chủng virus DkNA72-2007; DkNA114-2007; CkDT382-2008 và
DkTG926-2009, (M: Marker λ HindIII; 1: DkNA72-2007; 2: DkNA114-2007; 3: CkDT382-2008; 4:
DkTG926-2009). (B): DNA gen PB1 của 2 biến chủng virus DkQT801-2011 và DkQT802-2011 (DNA đầu
3’- gen PB1, 1: DkQT801-2011; 2: DkQT802-2011; và DNA đầu 5’- gen PB1, 3: DkQT801-2011; 4: DkQT802-2011).
- Cỏc mẫu kiểm tra DNA đầu 3’- và 5’- gen PB1 lần lượt sau phản ứng PCR với từng cặp mồi KPB1F – PB1R3 và PB1F3 – KPB1R theo thứ tự, của 2 biến chủng virus DkQT801-2011 và DkQT802-2011, đều cho kết quả 1 sản phẩm DNA biểu hiện là 1 băng sỏng trờn hỡnh điện di. Cỏc sản phẩm DNA núi trờn ở cỏc mẫu tương ứng cú độ dài lần lượt là 1,7 kb và 0,8 kb, đỳng bằng độ dài của cỏc đoạn DNA đầu 3’- và 5’- gen PB1 dự kiến với 2 cặp mồi thiết kế theo thứ tự (Hỡnh 3.3B). Tổng độ dài hai đoạn sản phẩm DNA đầu 3’- và 5’- gen PB1 khoảng 2,5 kb, ở mỗi biến chủng virus DkQT801-2011 và DkQT802-2011.
+ Kết quả kiểm tra DNA gen PA thu nhận sau phản ứng PCR:
Cả 6 mẫu kiểm tra DNA gen PA thu nhận sau phản ứng PCR của 06 biến chủng virus cỳm A/H5N1 nghiờn cứu, đều cho một sản phẩm DNA thể hiện là 1 băng sỏng trờn hỡnh điện di cú độ dài khoảng 2,2 kb, tương ứng độ dài gen PA dự kiến với cặp mồi đặc hiệu KPAF – KPAR (Hỡnh 3.4).
Như vậy, DNA cỏc gen PB2, PB1 và PA của 6 biến chủng virus cỳm A/H5N1 nghiờn cứu, đó được thu nhận thành cụng bằng phản ứng PCR sử dụng cỏc cặp mồi đặc hiệu với từng gen riờng biệt, từ khuụn cDNA hệ gen virus tương ứng.
Hỡnh 3.4. Kết quả điện di kiểm tra DNA gen PA của 6 biến chủng virus cỳm A/H5N1 trong nghiờn cứu thu nhận sau PCR
Ghi chỳ: (A): DNA gen PA của 4 biến chủng virus DkNA72-2007; DkNA114-2007; CkDT382-2008 và
DkTG926-2009, (M: Marker λ HindIII, 1: DkNA72-2007; 2: DkNA114-2007; 3: CkDT382-2008; 4:
DkTG926-2009). (B): DNA gen PA của 2 biến chủng virus DkQT801-2011 và DkQT802-2011 (1:
DkQT801-2011 và 2: DkQT802-2011)
Sản phẩm DNA cỏc gen PB2, PB1 và PA sau khi được tinh sạch được sử dụng làm nguyờn liệu cho dũng húa, lưu trữ DNA nguồn gen trong plasmid tỏi tổ hợp và giải trỡnh tự cỏc gen núi trờn.
* Kết quả dũng húa DNA cỏc gen PB2, PB1 và PA
Sản phẩm DNA plasmid tỏi tổ hợp cỏc gen PB2, PB1 và PA thu nhận sau dũng húa của 6 biến chủng virus cỳm A/H5N1 nghiờn cứu, được kiểm tra bằng phản ứng cắt DNA sử dụng enzym EcoRI. Sản phẩm sau phản ứng cắt DNA plasmid tỏi tổ hợp bằng enzym EcoRI, được điện di trờn thạch agarose 1% và trỡnh bày ở cỏc hỡnh 3.5 (gen PB2), hỡnh 3.6 (gen PB1) và hỡnh 3.7 (gen PA).
+ Kết quả thu nhận DNA plasmid tỏi tổ hợp chứa gen PB2:
- Cỏc mẫu DNA plasmid tỏi tổ hợp chứa gen PB2 cho kết quả dương tớnh, khi cú 3 sản phẩm DNA biểu hiện là 3 băng sỏng cú độ dài khỏc nhau đối chiếu với marker λ HindIII trờn hỡnh điện di, do trong gen PB2 cú chứa 1 vị trớ điểm cắt của enzym EcoRI bờn cạnh 2 vị trớ được thiết kế trờn DNA plasmid pCR2.1đ-TOPOđ. Trong đú, 1 băng sỏng cú độ dài 3,9 kb là của DNA plasmid pCR2.1đ-TOPOđ, 2 băng sỏng cũn lại lần lượt là 1,2 kb và 1,1 kb cho tổng độ dài 2,3 kb, tương ứng độ dài của đoạn DNA gen PB2 thu nhận sau phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu.
- Kết quả trong hỡnh 3.5 cho thấy, cú cỏc mẫu DNA plasmid tỏi tổ hợp dương tớnh chứa DNA gen PB2 của 6 biến chủng virus nghiờn cứu, gồm: DkNA72-2007
(mẫu 1, hỡnh 3.5A) và DkNA114-2007 (mẫu 2, hỡnh 3.5A), CkDT382-2008 (mẫu 2, hỡnh 3.5B), DkTG926-2009 (cỏc mẫu 1 và 2, hỡnh 3.5B); DkQT801-2011 (cỏc mẫu 3 và 4, hỡnh 3.5C) và DkQT802-2011 (cỏc mẫu 5 và 6, hỡnh 3.5C).
Hỡnh 3.5. Kết quả điện di kiểm tra cỏc mẫu DNA plasmid tỏi tổ hợp gen PB2 của 6 biến chủng virus cỳm A/H5N1 nghiờn cứu sau cắt bằng enzym EcoRI
Ghi chỳ: (A): Cỏc mẫu DNA plasmid tỏi tổ hợp gen PB2 của DkNA72-2007 và DkNA114-2007, (M:
Marker λ HindIII; 1: DNA plasmid tỏi tổ hợp gen PB2 của DkNA72-2007; 2 và 3: DkNA114-2007). (B): Cỏc
mẫu DNA plasmid tỏi tổ hợp gen PB2 của CkDT382-2008 (1, 2 và 3: mẫu 1, 2 và 3). (C): Cỏc mẫu DNA
plasmid tỏi tổ hợp gen PB2 của DkTG926-2009; DkQT801-2011 và DkQT802-2011, (1 và 2: DkTG926- 2009; 3 và 4: DkQT801-2011; 5 và 6: DkQT802-2011).
+ Kết quả thu nhận DNA plasmid tỏi tổ hợp chứa gen PB1:
Gen PB1 cú chứa 2 vị trớ điểm cắt của enzym EcoRI, nờn cỏc mẫu DNA plasmid tỏi tổ hợp dương tớnh chứa gen PB1 đủ độ dài, sẽ cú 4 băng sỏng biểu hiện sản phẩm DNA độ dài khỏc nhau trờn hỡnh điện di. Trong đú, 1 băng sỏng cú độ dài 3,9 kb của DNA plasmid, 3 băng sỏng cũn lại lần lượt là 1,6 kb; 0,5 kb và 0,2 kb cho tổng độ dài 2,3 kb, tương ứng đoạn DNA gen PB1 đủ độ dài thu nhận sau phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu.
- Kết quả điện di ở hỡnh 3.6 cho thấy, cú cỏc mẫu DNA plasmid tỏi tổ hợp dương tớnh chứa gen PB1 đủ độ dài, của 4 biến chủng virus DkNA72-2007 (mẫu 2, hỡnh 3.6A), DkNA114-2007 (cỏc mẫu 5 và 6, hỡnh 3.6A), CkDT382-2008 (cỏc mẫu 1, 2 và 3, hỡnh 3.6B) và DkTG926-2009 (cỏc mẫu 4 và 5, hỡnh 3.6B).
- Bốn mẫu DNA plasmid tỏi tổ hợp đoạn DNA đầu 3’- gen PB1 (1,7 kb), của 2 biến chủng virus DkQT801-2011 (mẫu 1, 2) và DkQT802-2011 (mẫu 3, 4), đều cho kết quả dương tớnh với 2 sản phẩm DNA biểu hiện là 2 băng sỏng trờn hỡnh điện di. Trong đú, 1 băng sỏng cú độ dài 3,9 kb là của DNA plasmid và 1 băng sỏng 1,6 kb
tương ứng độ dài đoạn DNA đầu 3’- gen PB1, do cú 1 đoạn DNA 0,1 kb khụng được thấy trờn hỡnh điện di (Hỡnh 3.6C).
Hỡnh 3.6. Kết quả điện di kiểm tra cỏc mẫu DNA plasmid tỏi tổ hợp gen PB1 của 6 biến chủng virus cỳm A/H5N1 nghiờn cứu sau cắt bằng enzym EcoRI.
Ghi chỳ: (A): Cỏc mẫu DNA plasmid tỏi tổ hợp gen PB1 đủ độ dài của DkNA72-2007 và DkNA114-2007,
(M: Marker λ HindIII; 1,2,3: DkNA72-2007; 4, 5 và 6: DkNA114-2007). (B): Cỏc mẫu DNA plasmid tỏi tổ
hợp gen PB1 của CkDT382-2008 và DkTG926-2009, (1, 2 và 3: CkDT382-2008; 4, 5 và 6: DkTG926-2009).
(C): Cỏc mẫu DNA plasmid tỏi tổ hợp DNA đầu 3’- gen PB1 của DkQT801-2011 và DkQT802-2011, (1 và
2: DkQT801-2011; 3 và 4: DkQT802-2011). (D): Cỏc mẫu DNA plasmid tỏi tổ hợp DNA đầu 5’- gen PB1
của DkQT801-2011 và DkQT802-2011, (1, 2: DkQT801-2011; 3, 4: DkQT802-2011).
- Tương tự, 4 mẫu DNA plasmid tỏi tổ hợp đoạn DNA đầu 5’- gen PB1 (0,8 kb), của 2 biến chủng virus DkQT801-2011 (mẫu 1, 2) và DkQT802-2011 (mẫu 3, 4), cũng cho kết quả dương tớnh với 3 sản phẩm DNA biểu hiện là 3 băng sỏng cú độ dài khỏc nhau trờn hỡnh điện di. Trong đú, 1 băng sỏng 3,9 kb là của DNA plasmid cựng với 2 băng sỏng cú độ dài lần lượt khoảng 0,5 kb và 0,2 kb, cho tổng độ dài là 0,7 kb tương ứng với độ dài sản phẩm DNA đầu 5’- gen PB1, do cú 1 đoạn DNA 0,1 kb khụng được thấy trờn hỡnh điện di (Hỡnh 3.6D). Tổng độ dài cỏc đoạn DNA đầu 3’- và DNA đầu 5’- của gen PB1, được gài trong DNA plamid tỏi tổ hợp khoảng 2,5 kb, phự hợp với tổng độ dài DNA gen PB1 thu nhận từ 2 cặp mồi thiết kế.
+ Kết quả kiểm tra DNA plasmid tỏi tổ hợp chứa DNA gen PA:
- Tương tự như gen PB1, gen PA cũng cú chứa 2 vị trớ điểm cắt của enzym
EcoRI, nờn cỏc mẫu DNA plasmid tỏi tổ hợp dương tớnh chứa gen PA, sẽ cú 4 băng sỏng biểu hiện 4 sản phẩm DNA độ dài khỏc nhau trờn hỡnh điện di. Trong đú, 1 băng sỏng 3,9 kb là DNA plasmid, 3 băng sỏng cũn lại cú độ dài lần lượt là 1,6 kb, 0,4 kb và 0,2 kb cho tổng độ dài 2,3 kb, bằng độ dài đoạn DNA gen PA thu nhận với cặp mồi đặc hiệu.
Hỡnh 3.7. Kết quả điện di kiểm tra cỏc mẫu DNA plasmid tỏi tổ hợp gen PA của 6 biến chủng virus cỳm A/H5N1 nghiờn cứu sau cắt bằng enzym EcoRI.
Ghi chỳ: (A): Cỏc mẫu DNA plasmid tỏi tổ hợp gen PA của 4 biến chủng virus DkNA72-2007, DkNA114-
2007, CkDT382-2008 và DkTG926-2009 (M: Marker λ HindIII, 1 và 2: DkNA72-2007; 3 và 4: DkNA114-
2007; 5 và 6: CkDT382-2008; 7 và 8: DkTG926-2009). (B): Cỏc mẫu DNA plasmid tỏi tổ hợp gen PA của 2
biến chủng virus DkQT801-2011 và DkQT802-2011 (1,2, 3: DkQT801-2011 và 4, 5, 6: DkQT802-2011). - Kết quả trong hỡnh 3.7 cho thấy, cú cỏc mẫu DNA plasmid tỏi tổ hợp dương tớnh chứa DNA gen PA của 6 biến chủng virus nghiờn cứu, bao gồm: DkNA72-2007 (mẫu 1, hỡnh 3.7A), DkNA114-2007 (mẫu 4, hỡnh 3.7A), CkDT382-2008 (cỏc mẫu 5 và 6, hỡnh 3.7A) và DkTG926-2009 (cỏc mẫu 7 và 8, hỡnh 3.7A), DkQT801-2011 (mẫu 2, hỡnh 3.7B) và DkQT802-2011 (mẫu 4, hỡnh 3.7B).
Như vậy, DNA sản phẩm PCR của cỏc gen PB2, PB1 và PA trong hệ gen 6 biến chủng virus cỳm A/H5N1 nghiờn cứu, gồm: DkNA72-2007, DkNA114-2007, CkDT382-2008, DkTG926-2009, DkQT801-2011 và DkQT802-2011, đó được gài thành cụng trong plasmid tỏi tổ hợp.
Cỏc mẫu DNA plasmid tỏi tổ hợp dương tớnh chứa cỏc gen PB2, PB1 và PA kể trờn, được bảo quản ở nhiệt độ -200C và sử dụng làm khuụn cho phản ứng PCR giải trỡnh tự cỏc gen tương ứng.