Trong nước đã có một số nghiên cứu liên quan đến phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn từ thực phẩm lên men dùng cho nghiên cứu lên men sản xuất sữa chua và phát triển thực phẩm chức năng probiotic. Tuy nhiên, tại thời điểm nghiên cứu vẫn chưa có bộ giống khởi động nào được đưa vào sản xuất.
Có thể kể đến một số các nghiên cứu của các tác giả:
Tác giả Bùi Thế Vinh, Hà Thanh Tồn (2008) cơng bố bài báo ―Kiểm tra hoạt lực của hệ vi khuẩn lactic trong sản xuất sữa chua‖ trong Tạp chí khoa học Trường Đại học Cần Thơ, 10, tr.203-212.
Trần Thị Ngọc Mai, Đại học Kỹ Thuật Tp. Hồ Chí Minh (2010) đã nghiên cứu thành công trong việc phối hợp 1 chủng Lactobacillus sp. và nấm men
Saccharomyces sp. trong lên men kefir.
Nhóm nghiên cứu của tác giả Nguyễn Ngọc Thạnh (2015), trường Đại học Cần Thơ nghiên cứu đề tài phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic ứng dụng trong lên men sữa chua bổ sung tảo Spirulina
Báo cáo của Đoàn nh Dũng, Đại học Cần Thơ (2015) cho thấy có thể sử dụng
Chƣơng 2 – NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1 Nguyên vật liệu, hoá chất và tthiết bị
2.1.1 Vi sinh vật
Các chủng vi khuẩn lactic được lưu giữ tại Bảo tàng giống chuẩn Vi sinh vật Việt Nam (VTCC).
Vi sinh vật kiểm định: Bacillus cereus VTCC-B-613, Listeria innocua ATCC
33090, Escherichia coli VTCC-B-0482, Staphylococcus aureus VTCC-B-0658, Micrococcus luteus VTCC-B-0644, Salmonella enterica VTCC-B-0480
2.1.2 Hóa chất, thiết bị
Các hóa chất ni cấy và định tính, định lượng từ các hãng Sigma, Merk, Oxoid, Waka (Nhật Bản), Trung Quốc và Việt Nam.
Thiết bị: Máy móc thiết bị sử dụng trong nghiên cứu đều thuộc Viện Vi Sinh Vật và Công nghệ Sinh học – ĐHQGHN : Tủ cấy vô trùng (Nuaire, Mỹ), tủ ấm (Binder, Đức), nồi khử trùng (Himaraya, Nhật Bản), máy lác ổn nhiệt (Certomat BS-1, Đức), tủ sấy (Carbolite, nh), máy đo quang phổ (Beckman Coulter, Mỹ), kính hiển vi quang học (Olympus, Nhật), tủ lạnh (Hitachi, Thái Lan), tủ lạnh – 80oC (Nuaire, Mỹ), máy ly tâm lạnh (C30P Sartorius Group, Đức), máy PCR (PE-9700, ABI, Mỹ), máy đọc trình tự tự động (ABI 3100 Avant, Mỹ), thiết bị côc mẫu (Mỹ), máy ly tâm lạnh (Beckman Coulter, Mỹ), máy đo pH Horiba F-51 (Nhật Bản) …
2.1.3 Môi trƣờng
MRS (MT1) (g/l): Peptone-10; Cao thịt-10; Cao nấm men-5; Glucose -20; Tween 80-1; Amonium citrate- 2; Sodium acetate- 5; MgSO4- 0,1; MnSO4- 0,05; K2HPO4- 2; Nước cất – 1lít; pH6,5±0,2.
MT3 (g l): Glucose- 13,4; cao thịt- 7,2; Sodium pyruvate- 3,4; Potassium phosphate-2; Sodium acetate-5; Ammonium citrate-2; pH 6,5
MT4 (g l): Glucose- 20; Cao nấm men- 6; Potassium dihydrogen phosphate- 0,25; Sodium acetate- 5; Triammonium citrate- 2; MgSO4- 0,05; pH 6,5
MT5 (SDM) (g/l): Cao nấm men- 3; Peptone- 5; Cao malt- 3; Glucose- 10; Sodium sulphite- 2,92; Basic fushsin- 0,47; pH 6.
MT6 (g l): Peptone- 6; Cao nấm men- 6; Potassium dihydrogen phosphate- 1,5; Ammonium citrate- 1; Tween 80- 1; Sodium acetate- 1; Citric acid- 0,5; Magnesium sulphate- 0,4; Manganese sulphate- 0,05; Glucose- 30; pH 6,8
MT7 (SPY) (g l): Peptone- 25; Glucose- 25; Cao nấm men- 25; pH6,5ate- 0,4; Manganese sulphate- 0,05; Glucose- 30; pH 6,8
MT8( g l): Lactose- 17,7; Cao nấm men- 18,6; Calcium chloride- 0,9; pH6,5 N (g l): Peptone- 5; Cao thịt- 3; NaCl- 5; pH 6,8
Bản thạch chứa cơ chất (g/l): Thạch – 16; casein -1 Nguồn sữa: Sữa TH thanh trùng không đường.
2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1 Hoạt hóa chủng giống 2.2.1 Hoạt hóa chủng giống
Các chủng vi khuẩn lactic thuộc hai chi Lactobacillus và Streptococcus được lưu giữ tại VTCC trong tủ lạnh sâu trong tủ lạnh -80oC. Các chủng được hoạt hóa lại bằng phương pháp cấy ria trên mơi trường thạch MRS . Sau đó ủ tại 37oC, trong 48-72 giờ, sau đó kiểm tra khả năng sinh trưởng và độ tinh sạch, so sánh với mô tả ban đầu của chủng giống. Những chủng có khả năng sống sót được lựa chọn để làm thí nghiệm.
2.2.2 Đánh giá khả năng lên men sữa
2.2.2.1 Khả năng lên men đường lactose:
Sau khi các chủng được hoạt hóa trên MRS dịch thể, tiếp tục nuôi cấy trên môi trường dịch thể MRS dịch thay thế glucose bằng lactose (10g/l) và bổ sung thêm chất chỉ thị red phenol (0,17g/l). Đổ 1ml dầu khống lên bề mặt mơi trường ni cấy để tạo điều kiện kị khí. Các chủng L này được nuôi tĩnh ở 37oC trong 24 – 48 giờ. Quan sát dịch nuôi cấy, dấu hiệu vi khuẩn lên men sử dụng đường lactose là sự chuyển màu từ đỏ sang vàng của môi trường nuôi cấy do axit sinh ra làm giảm pH làm thay đổi màu của phenol red.
2.2.2.2 Thử khả năng lên men sữa
Các chủng L được nuôi tĩnh trên môi trường dịch thể MRS, nuôi cấy tại 37oC, trong 24 giờ. Thu dịch nuôi cấy, ly tâm tách riêng dịch enzyme ngoại bào và phần sinh khối thu sinh khối tế bào. Bổ sung 1ml dịch enzyme vào 5ml dung dịch sữa (Skim milk 100g/l, CaCl2 1,5g/l) đã ủ ở 55oC trong 5 phút, sau đó ủ tiếp 40oC. Sinh khối của các chủng được bổ sung vào 10ml sữa trong ống nghiệm, ủ 42oC. Sử dụng sữa tươi thanh trùng bổ sung đường saccharose (120g l).Theo dõi khả năng đông tụ sữa của từng mẫu. Khả năng đông tụ sữa được được đánh giá dựa vào các chỉ tiêu: Đông tụ nhanh, cấu trúc sữa mịn không tách nước [20].
2.2.3 Nghiên cứu các đặc tính probiotic của các chủng LAB
Khả năng sinh axit hữu cơ
Chủng L được nhân khởi động 24 giờ trên môi trường MRS dịch thể, 5% giống khởi động được cấy truyền sang môi trường MRS dịch, ủ 48 giờ. Sau đó hút 5ml dịch ni ly tâm thu dịch. Chuẩn độ bằng NaOH 1N để xác định thể tích axit được sinh ra [63].Thí nghiệm lặp lại 3 lần.
o
T = VNaOH cần dùng ×10 Hàm lượng axit lactic (mg/ml) = o
T×0.009 (oT: độ Therner, 1oT = 9 mg axit lactic )
Khả năng sinh protease
Các chủng L được nuôi trên môi trường dịch thể MRS tại 37oC trong 48 giờ. Thu dịch nuôi, ly tâm loại bỏ tế tào. Nhỏ dịch enzyme ngoại bào thu được vào các giếng đã đục s n trên đĩa thạch chứa 0,1% cơ chất casein. Sau khi ủ ở nhiệt độ 37oC trong 24 giờ, sau đó ngâm trong dung dịch axit acetic 1%. Hoạt tính protease được xác định dựa trên sự xuất hiện vòng trong phân giải casein xung quanh lỗ thạch.
Khả năng sinh β – galactosidase:
Các chủng L được nuôi cấy trong môi trường MRS dịch thể ở 37oC. Sau 24 giờ, thu dịch 1,5ml ni cấy đo OD600, sau đó ly tâm thu cặn tế bào. Tiếp theo, hòa lại cặn tế bào với 1,5ml nước muối sinh lý, vontex đều. Sử dụng ống định lượng:
-Các mẫu ống chứa 0,5ml dịch đã hòa lại với nước muối sinh lý và đệm Z. - Ống đối chứng chưa 1ml đệm Z
Bổ sung SDS 0,1% và chloroform vào các ống định lượng trên, lắc nhẹ và ủ ở 30oC trong 2 phút. Tiếp theo bổ sung tiếp 0,2ml ONPG và ủ ở 30oC. Sau đó, quan sát các ống định lượng, ghi thời gian các ống đổi sang màu vàng và dừng bằng cách bổ sung 0,5ml Na2CO3 1M, lắc nhẹ. Sau đó đo OD420 và OD550 của các ống, dùng ống đối chứng làm blank [57].
Khảo sát khát đặc tính tan máu
Mơi trường thạch MRS được hấp khử trùng 121oC, 20 phút. Sau đó làm nguội đến 45oCvà bổ sung 5% máu cừu. Ria cấy các chủng lactic trên bề mặt đĩa thạch ủ tại 37oC trong 48 giờ, quan sát khả năng tạo vùng tan huyết (β). Sử dụng chủng
Khả năng chịu muối mật:
Dựa theo phương pháp của Jatindra 8. Các chủng lactic nuôi trên MRS qua đêm, chuyển sang mơi trường dịch thể MRS có bổ sung muối mật với các nồng độ: 0%; 0,2%; 0,3%; 0,5% và 1%. Đánh giá khả năng sống sót sau 48 giờ ở 37 o
C. Ghi lại nồng độ muối mật cao nhất vẫn cho thấy sự sinh trưởng của vi khuẩn khi ria trên MRS. Thí nghiệm lặp lại 3 lần.
Khả năng chịu pH thấp
Dựa theo phương pháp nghiên cứu của Erkkila và Petaja 13. Các chủng vi khuẩn lactic được nuôi qua đêm trên dịch thể MRS. Thu 1ml sinh khối (108 CFU/ml), ly tâm 10000 vòng/phút trong 5 phút, bổ sung đệm PBS pH 2, pH 3 và pH 7 ủ trong 3 giờ. Ly tâm, pha bằng nước muối sinh lý, Sau đó, định lượng các chủng LAB sống sót bằng phương pháp đếm khuẩn lạc trên đĩa thạch MRS. Khả năng sống sót của vi khuẩn sau khi để trong điều kiện pH thấp ≥50% được coi là vi khuẩn có khả năng chịu pH thấp.
Tỉ lệ sống sót =
Trong đó: N - Log số khuẩn lạc pH thấp A - Log Số khuẩn lạc pH7
Thử nghiệm khả năng chịu điều kiện ruột, dạ dày
Thí nghiệm này thực hiện tho phương pháp được Pinto mô tả năm 2006[57]. Nuôi cấy vi sinh vật trên môi trường Skim milK (15%) với mật độ ban đầu khoảng 108CFU/ml, ủ qua đêm. Pha tỉ lệ 1:1 với dung dịch A (6,2g/l NaCl, 2,2g/l KCl, 0,22g/l CaCl2, 1,2g/l NaHCO3, Lyzozyme bổ sung sa cho nồng độ cuối đạt 100ppm, ủ trong 5 phút ở 37oC. Sau đó mẫu được pha lỗng tiếp tỉ lệ 3:5 với dung dịch điện giải (6,2g/l NaCl, 2,2g/l KCl, 0,22g/l CaCl2 and 1,2g/l NaHCO3) điều chỉnh pH 2,5 và 0,3% pepsin, ủ trong 1 giờ. Tiếp tục pha loãng với dịch tá tràng nhân tạo pH 7,2 (6,4g/l
NaHCO3, 0,225g/l KCl, 1.28g/l NaCl, 0,5% muối mật và 0,1% pancreatin, sau 3 giờ định lượng số vi sinh vật cịn sống sót bằng phương pháp đếm khuẩn lạc trên đĩa thạch
[57].
Thử nghiệm tính kị nước bề mặt tế bào
Chủng L được phát triển trong môi trường MRS dịch ở 37oC trong 18 giờ và ly tâm ở 12000 g trong 5 phút ở 4oC. Phần cặn thu được đã được rửa hai lần trong đệm phosphate pH6,5, và hịa lại trong cùng một đệm. Sau đó, 1ml của dịch trên được đo độ hấp thụ ở 560 nm. 3ml dung dịch L được trộn với 0,6ml n-hexadecan (Sigma- Aldrich) và khuấy trong 120 giây sử dụng vortex. Sau đó, các dịch này được để tĩnh 1 giờ ở nhiệt độ phòng để tách ổn định 2 lớp. Loại bỏ phần dịch hexadecane cẩn thận và độ hấp thụ được đo ở 560nm với phần nước. Tỷ lệ phần trăm kị nước được thể hiện như sau: %kị nước [( 0- ) 0]×100, nơi 0 và là các giá trị độ hấp thụ của dung dịch nước giai đoạn trước và sau khi tiếp xúc với n-hexadecan, tương ứng (Chauviere và cộng sự, 1992). Các thí nghiệm kị nước được thực hiện trong 3 lần.
Khả năng kháng vi sinh vật gây bệnh
Các chủng L được cấy từ ống nghiệm sang bình 250ml chứa mơi trường MRS dịch và ủ ở 37oC, trong 48 giờ. Dịch nuôi cấy của các chủng được ly tâm riêng ở 10.000 vòng trong 5 phút. Dịch nổi được thu lại sau khi ly tâm và được chia 2 phần: phần 1 dùng để thử nghiệm khả năng kháng vi khuẩn gây bệnh từ dịch nuôi và phần 2 dùng cho thử nghiệm khả năng sản sinh bacteriocin kháng khuẩn bằng cách chỉnh về pH 6,5 theo như mô tả của Leite và cs., (2015).
Sau khi nuôi 37oC trong 24 giờ quan sát vịng vơ khuẩn xung quanh các giếng. Kết quả dương tính khi đường kính vịng ức chế 1mm. Thí nghiệm lặp lại 3 lần.
Khả năng kháng chất kháng sinh:
Nghiên cứu thực hiện trên 5 loại kháng sinh ampicillin (10µg), amoxicillin (10µg), cefalexin (30µg), chloramphenicol ((30µg), tetracycline (30µg) 31. Sử dụng phương pháp khuếch tán trên giếng thạch để đánh giá khả năng kháng chất kháng sinh
(National Committee for Clinical Laboratory Standards NCCLS, 1993). Khơng xuất hiện vịng kháng được ghi nhận là vi khuẩn có khả năng kháng lại chất kháng sinh đó.
2.2.4 Khảo sát khả năng sinh trƣởng của các chủng
Các chủng vi khuẩn được nuôi trên dịch thể MRS . Sau 24 giờ nuôi tại 37oC. Tại các thời điểm nuôi cấy 18 giờ, 21 giờ, 24 giờ, 27 giờ và 30 giờ, mật độ vi khuẩn được xác định dựa trên phương pháp đếm số khuẩn lạc trên đĩa thạch (CFU).
2.3 Phân loại
2.3.1 Phân loại bằng hình thái
- Quan sát hình thái tế bào và khuẩn lạc vi khuẩn: Vi khuẩn được cấy ria trên môi trường thạch MRS ở 37o
C, sau 48 giờ lấy ra quan sát hình thái bề mặt, màu sắc, kích thước.
Phương pháp chụp ảnh khuẩn lạc
Chủng vi khuẩn nghiên cứu được cấy lên môi trường thạch MRS và được nuôi ở 37oC trong 48 giờ. Sau đó, vi khuẩn được cấy ria 3 pha lên môi trường thạch MRS và được nuôi ở nhiệt độ 37oC. Sau 48 và 72 giờ, từng khuẩn lạc mọc riêng rẽ trên đĩa thạch được quan sát, mô tả và chụp ảnh dưới kính lúp kết nối máy tính (Stemi 2000, Carl Zeiss).
Phương pháp nhuộm soi và chụp ảnh tế bào
Từ tế bào được nuôi cấy ở 37oC trong 48 giờ, vi khuẩn được cố định trên lam kính và được nhuộm với dung dịch tím kết tinh (2 g tím kết tinh, 20 ml cồn 95o, 0,8 g ammonium oxalate và 100 ml nước cất) trong 1 phút. Sau đó, mẫu được cố định với dung dịch iốt (2 g KI, 1 g I2 và 100 ml nước cất). Sau khi tẩy bằng cồn 95o, tế bào được nhuộm với dung dịch safranin (0,4 g safranin O, 20 ml cồn 95o và 80 ml nước cất). Sau khi rửa trơi dung dịch safranin, hình thái tế bào vi khuẩn được quan sát và
chụp ảnh dưới vật kính soi dầu có độ phóng đại 1.000 lần trên kính hiển vi (Axio A1 imager, Carl Zeiss).
2.3.2 Phân loại bằng sinh học phân tử
Tách chiết ADN
ADN của các chủng vi khuẩn nghi ngờ bifidobacteria được tách chiết theo phương pháp của Gabor và cộng sự (2003) [28] với một số bước cải biến để phù hợp với điều kiện phịng thí nghiệm
- Ly tâm 1,5ml dịch nuôi vi khuẩn lấy sinh khối tế bào - Hoà sinh khối tế bào trong 100 l TE.
- Thêm 0,4 mg lysozyme. Trộn đều, ủ 37oC trong 1 giờ. Trộn đều 3 phút - Thêm 100 l SDS 10% (w v), trộn đều 2-3 phút trộn thật kỹ, ủ 37o
C/30 phút. - Thêm một thể tích tương đương phenol: chloroform: isoamyl alcohol (PCI), trộn đều. Ly tâm 15.000v p, 15phút. Chuyển lớp dịch phía trên sang ống Eppendoft khác.
- Thêm 8 l RN se 3 mg ml, trộn đều, ủ ở 37oC trong 30 phút - Thêm 12 l proteinase K (5 mg ml), trộn đều, ủ 15 phút ở 56oC
- Thêm một thể tích tương đương phenol: chloroform: isoamyl alcohol (PCI), trộn đều. Ly tâm 15.000v p, 15 phút. Chuyển lớp dịch phía trên sang ống Eppendoft khác.
- Thêm 1 thể tích tương chloroform: isoamyl alcohol, trộn đều, ly tâm 15.000v p, 15 phút. Chuyển lớp dịch phía trên sang ống Eppendoft khác.
- Thêm 1 10 V Natri acetat 3M và 1ml Ethanol 100%, đảo trộn. Đặt trong đá 30 phút.
- Rửa tủa bằng ethanol 70%.
- Làm khô DN bằng máy cô quay chân không. - Hoà tan DNA trong 50-100l nước hoặc TE. - Kiểm tra các sản phẩm của PCR bằng điện di
Đun tan 1% agarose (dung dịch 50X T E: 2ml, nước cất: 98 ml, agarose: 1g) để ấm, đổ vào khuôn, đợi cho nguội và đặt tấm gel vào trong máy điện di, ngập trong 300ml dung dịch 1 X T E. Trộn 2 l dung dịch 6X loading buffer với 5 l mẫu trộn đều, nhỏ vào giếng. Chạy điện di bằng dòng điện một chiều với điện thế 100V, cưòng độ dòng điện 80 m trong 30 phút, bỏ ra ngâm trong dung dịch Et r (nồng độ 0,5 l ml) 20 phút vớt ra. Quan sát trên máy soi gel.
Phân loại dựa trên trình tự gen ARNr 16S
Phản ứng PCR được sử dụng để khuếch đại đoạn gen ARNr 16S với cặp mồi (27F: (5'- AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG -3') và 1525R (5'- AAAGGAGGTGATCCA GCC-3') [84]. Chu trình nhiệt: 95oC - 3 phút 95oC - 30giây 56oC - 15 giây 30 chu k 72oC - 1 phút 72oC - 5 phút 4oC - Tinh sạch sản phẩm PCR
Sử dụng bộ kit QI gen theo chỉ dẫn của nhà sản xuất.
- Thêm dung dịch P I vào mẫu theo thể tích 5:1. Trộn đều. - Cho hỗn hợp mẫu vào cột, ly tâm 10.000 v p trong 1 phút . - Đổ bỏ dịch phía dưới cột.
- Đổ bỏ dịch dưới cột
- Ly tâm tiếp 10.000 v p trong 1 phút